《Biochar》：Efficient allelochemical removal from continuous capsicum cultivation using horseradish peroxidase–loaded biochar
编辑推荐：
本研究针对辣椒连作障碍中酚酸类自毒物质持续累积的难题，开发了一种通过K2CO3蚀刻制备高比表面积生物炭(CBC)并固定辣根过氧化物酶(HRP)的新材料HRP-CBC。该材料对阿魏酸(FA)等酚酸类物质展现出高效降解性能（6小时内对20 mg L-1FA去除率达100%），且具有良好的稳定性、重复使用性和环境相容性，为克服作物连作障碍提供了绿色高效的酶固定化解决方案。
在全球蔬菜种植中，辣椒因其较高的营养和经济价值而占据重要地位。然而，受限于耕地资源的有限性与旺盛的市场需求，辣椒的连作栽培模式已被广泛采用。遗憾的是，连续种植超过20年会严重抑制辣椒的生长，甚至导致植株死亡。其核心障碍在于辣椒根系分泌的酚酸类自毒物质，如阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、肉桂酸和香豆酸等，在土壤中不断累积。这些物质会抑制细胞分裂、影响相关基因表达、降低植物激素水平和活性，并阻碍根系对水分和养分的吸收。其中，土壤中阿魏酸的浓度相对较高，可达约7.44 μg g-1。目前，针对这些自毒物质的治理主要有物理、化学和生物三种方法。物理和化学方法往往能耗高且可能造成二次污染，而生物方法则因其高效、实用和环境友好而显示出优势。生物防治主要利用生防菌或酶制剂，但筛选合适的生防菌过程复杂，且其在极端环境条件下的表现往往不佳。因此，开发具有靶向性、适应性强且高效的酶基生物技术，特别是针对阿魏酸等自毒物质的降解，成为当前研究的重要方向。
酶作为生物系统中的关键催化剂，与传统无机催化剂相比，具有可生物降解、特异性强、毒性低、反应条件温和及环境友好等优势。在木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶、漆酶和辣根过氧化物酶(HRP)等多种氧化酶中，HRP因其以H2O2为电子受体的高效催化机制而备受关注。HRP能在其活性中心通过Fe(III)/Fe(IV)循环高效分解H2O2，产生的自由基不仅能引发污染物的自聚合，还能通过电子转移直接矿化小分子有机物，在降解酚类、染料和药物等有机污染物方面展现出巨大潜力。然而，游离HRP的催化活性易受pH、温度、储存时间和重复使用性等因素影响。将HRP固定化可以显著增强其稳定性和耐受性，保持酶活性，降低应用成本。交联法是一种关键的酶固定化方法，能使酶与载体上的功能基团形成稳定的共价键，从而实现高酶载量、低酶泄漏率、强环境适应性和改善的性能。载体选择对酶的负载效率和稳定性影响显著。生物炭(BC)是一种高效、经济、环境友好的材料，其丰富的多孔结构和高比表面积能为酶提供充足的负载位点；表面的含氧官能团（如羧基和羟基）可与酶形成稳定的共价键；良好的化学稳定性和生物相容性则能有效保护酶活性并改善土壤的理化性质。此外，生物炭对连作土壤具有缓解作用，其表面形态可通过酸碱改性或熔盐法进一步优化以增强酶负载能力。特别是碱改性，与酸改性和熔盐法相比，能显著增加其比表面积和含氧官能团。
为了应对辣椒连作障碍这一挑战，张雪艳等研究人员在《Biochar》上发表了他们的研究成果。他们提出假设：碱性蚀刻可显著增加生物炭的比表面积和活性位点数量，从而有效增强HRP的固定化效果；基于戊二醛交联构建的固定化HRP体系，相较于游离酶，应具备更优异的催化性能，包括更宽的pH/温度适应范围以及对阿魏酸等酚酸物质的高效降解能力；同时，该固定化HRP-CBC体系可通过酶-载体协同作用显著减少有毒中间产物的积累，并在重复使用过程中保持稳定的降解活性。
研究人员为开展本研究，主要运用了以下几项关键技术方法：首先，以烟草茎秆为原料，通过K2CO3蚀刻法制备了具有超高比表面积和孔体积的碳酸盐改性生物炭(CBC)，并比较了KOH和柠檬酸钾改性生物炭(KBC, NBC)的特性。其次，在戊二醛交联条件下将HRP负载于CBC上，形成HRP-CBC，并采用考马斯亮蓝法测定酶负载量和活性。通过测定不同pH、温度、储存时间和重复使用次数下的酶活性，系统评估了固定化酶的稳定性。再者，通过高效液相色谱(HPLC)分析了HRP-CBC对不同酚酸自毒物质（阿魏酸、香草酸、肉桂酸、对羟基苯甲酸）的降解效率，并考察了各种环境因素（pH、温度、底物浓度、材料投加量、H2O2浓度、反应时间）的影响。此外，还通过辣椒种子发芽实验评估了降解产物对种子发芽和根长的生态毒性变化。最后，利用液质联用(LC-MS)和电子自旋共振(ESR)等技术鉴定了降解中间产物并推测了降解途径和自由基机制，并采用ECOSAR软件评估了中间产物的生态毒性。
3.1 改性生物炭固定辣根过氧化物酶的理化特性
研究人员比较了三种碱蚀刻对生物炭表面形态的影响。结果表明，比表面积大小顺序为：CBC > NBC > KBC > BC。其中，CBC具有最大的孔径和孔容。这归因于K+在高温下与纤维素多糖单元中的糖苷键反应，以及CO32-生成的CO2和CO产生的气体膨胀效应。
碱处理后，BC的吸附-脱附等温线从I型转变为具有H4滞后回线的IV型。三种碱改性BC的孔径对应于微孔和介孔材料。固定化后，孔径从2.1 nm增加到4.0 nm，这可能是由于HRP通过非共价力选择性吸附在微孔入口或外表面，覆盖了微孔开口，或是HRP密集固定在富含微孔的区域表面，间接“占据”了微孔。酶负载能力和相对酶活性是负载浓度和负载后酶活性的关键指标。在样品中，HRP-CBC表现出最高的酶负载能力（311.46 U g-1）和相对酶活性，其次是HRP-NBC、HRP-KBC和HRP-BC。酶负载能力和酶活性与载体的比表面积、孔径和孔体积密切相关。HRP与CBC表面残留的戊二醛发生共价交联，可能导致HRP-CBC的比表面积相较于CBC减少了96.84%。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析显示，HRP-CBC在1530 cm-1处出现了蛋白质酰胺I带的特征峰，在1377和1183 cm-1处出现了胺基C-N伸缩振动峰，证实了HRP成功固定在载体上。
扫描电子显微镜(SEM)图像显示，BC表面孔隙分布均匀，而CBC表面的孔隙因K2CO3蚀刻碳质结构而更深、直径更大。HRP-CBC表面可见聚集的酶形成的厚酶层，进一步证实了酶的成功固定。能量色散X射线光谱(EDS)分析和元素面分布图结果确认HRP已成功固定在CBC载体上，HRP-CBC中N的质量比是CBC的5.7倍，这主要源于HRP分子中肽键和氨基的贡献，O和N的相对含量在固定化后也显著增加。
3.2 固定化辣根过氧化物酶的稳定性
HRP和HRP-CBC的酸碱稳定性测试表明，两种酶在pH 7.0时活性最高。在碱性条件下，HRP-CBC表现出优于游离HRP的稳定性，这归因于生物炭基质中功能基团的缓冲作用。温度稳定性数据显示，HRP和HRP-CBC的最适温度分别为30°C和40°C。在70°C时，HRP-CBC仍能保持61.4%的相对酶活性，而游离HRP仅保留31.9%，表明CBC的保护性框架增强了HRP的热稳定性。在储存稳定性方面，在4°C和25°C下储存30天后，HRP-CBC的相对活性保留率（分别为68.8%和57.9%）均高于游离HRP（62.5%和42.6%）。在重复使用性方面，HRP-CBC循环使用7次后，相对酶活性下降至35.4%，这可能与酶在反复洗涤中的流失、自由基的积累以及降解产物阻塞活性位点有关。动力学参数测定显示，与游离HRP相比，HRP-CBC的米氏常数(Km)增加，表明其对底物的亲和力降低，而最大反应速率(Vmax)降低，可能是由于载体的空间位阻效应或固定化对酶活性中心构象的影响所致。
3.3 固定化辣根过氧化物酶对酚酸自毒物质降解的影响
基于典型的土壤pH范围，评估了pH（5.0-8.0）对HRP、HRP-BC和HRP-CBC去除阿魏酸(FA)的影响。HRP-CBC的FA去除效率显著高于其他两种材料，表明碱蚀刻增强了酶固定化并改善了酚酸去除效果。三种材料在溶液pH为7.0时均表现出最高的FA去除率。在25-55°C温度范围内，FA去除效率遵循HRP-CBC > HRP-BC > HRP的趋势，表明酶固定化显著增强了HRP的热稳定性。在35°C时，HRP-BC和HRP-CBC的FA去除率达到峰值。当酶剂量从1 U mL-1增加到10 U mL-1时，三种材料的FA去除率均显著增加，HRP-CBC的去除率从54.2%提高到79.5%。对于20至70 mg L-1的初始FA浓度，总体去除率趋势为HRP-CBC > HRP-BC > HRP，且所有三种材料的去除率均随初始FA浓度的增加而逐渐降低。在酶促反应中，H2O2作为共底物激活HRP。当c(H2O2)/c(FA)比率从0.15增加到1时，三种材料的FA去除率从20-30%逐渐提高到85-97%。三种材料的去除效率总体上遵循HRP-CBC > HRP-BC > HRP的顺序，突出了酶固定化在保持活性方面的优势。HRP-CBC在6小时内实现了100%的FA去除率，比HRP和HRP-BC快2小时，表明其具有最快的FA去除速率。FA去除反应速率常数k的顺序为HRP-CBC > HRP-BC > HRP。总有机碳(TOC)矿化度分析表明，在HRP-CBC降解FA的过程中，TOC矿化率逐渐增加，中间有机产物减少。HRP-CBC对香草酸(HVA)、肉桂酸(CA)、对羟基苯甲酸(HBA)和反式肉桂酸(TC)四种酚酸均表现出良好的去除效率，在2小时内去除率均超过50%，显示了其对多种酚酸污染物的广谱适用性。
辣椒种子发芽实验表明，经HRP-CBC降解处理后的FA溶液，其对辣椒种子发芽率和根长的抑制作用消失，发芽率和根长恢复到与对照组无显著差异的水平。土壤降解实验显示，在第11天，HRP-CBC对FA的降解率达到84.68%，表明其在土壤实际应用中的潜力。
3.4 FA降解途径及中间产物毒性评估
通过电子自旋共振(ESR)分析，证实反应体系中产生了·OH、1O2和·O2-等活性氧物种，表明自由基和非自由基途径共同参与了HRP-CBC体系对FA的降解。液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析鉴定了催化反应的中间产物，推测了三条可能的降解途径。途径一：FA与·OH通过亲电加成反应生成3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-氧代丙酸，继而氧化产生丹皮酚和香兰素，香兰素的甲氧苯基断裂形成原儿茶酸，随后脱羧生成4-羟基苯甲酸，最后苯环开环生成富马酸、草酸等小分子化合物。途径二：FA与·OH反应形成松脂醇，随后C=C双键断裂。途径三：FA被·OH氧化生成2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，随后其C=C双键断裂形成4-乙基-2-甲氧基苯酚。
生态毒性评估显示，在HRP-CBC降解FA的过程中，部分中间产物表现出不同程度的毒性，但所有产物最终均转化为低毒或无毒物质，实现了污染物的解毒，这与TOC去除率和种子发芽率的结果一致。
4 结论
本研究通过K2CO3蚀刻制备了具有超大比表面积和孔隙结构的生物炭酶载体，并采用交联法优化了固定化HRP的负载量和酶活性，最大负载量达到311.46 U g-1。在不同反应条件下，HRP-CBC对阿魏酸(FA)的去除率均显著高于HRP和HRP-BC。在35°C、pH 7的条件下，使用2 U mL-1的HRP-CBC，可在6小时内完全去除20 mg L-1的FA。HRP-CBC对多种导致辣椒自毒的酚酸物质也表现出优异的降解能力。应用HRP-CBC降解FA能够消除FA对辣椒种子发芽率和根长的抑制作用。LC-MS和生态毒性分析表明，FA被降解为毒性显著降低的小分子有机物。HRP-CBC具备优异的稳定性、可重复使用性和抗逆性。因此，将HRP固定于改性生物炭上，为解决连作系统中的酚酸自毒物质问题提供了一种有前景的新策略。未来的研究应侧重于开展田间土壤实验，系统评估该技术在实际环境中的酚酸降解效率及其对作物生长的调控作用，以推动此项绿色修复技术从实验室研究走向田间应用。
