《Journal of Hazardous Materials》：Genome wide responses of the water flea,
Daphnia carinata, to 6PPD and its oxidation product 6PPD-quinone
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本研究利用水蚤Daphnia carinata构建了近完整的染色体水平基因组，并分析了其暴露于轮胎添加剂6PPD及氧化产物6PPD-Q后的多组学响应。结果显示，6PPD主要影响糖代谢和膜运输，而6PPD-Q则显著改变糖酵解、能量代谢及氧化应激相关通路，并涉及离子平衡和甲壳结构重塑。该研究证实D. carinata可作为监测轮胎污染物的敏感生物模型，揭示了污染物对能量代谢和生态功能的深层影响。
阿努帕玛·库马尔（Anupama Kumar）、坎达克尔·阿西夫·艾哈迈德（Khandaker Asif Ahmed）、陶·V·阮（Thao V. Nguyen）、莱昂·考特（Leon Court）、汤姆·沃尔什（Tom Walsh）、拉胡尔·拉内（Rahul Rane）、冈詹·潘迪（Gunjan Pandey）
CSIRO环境部，澳大利亚南澳大利亚州韦特校区（CSIRO Environment, Waite Campus, South Australia, Australia）
摘要
轮胎添加剂N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD）及其氧化产物6PPD-醌（6PPD-Q）在淡水生态系统中已被证实具有很强的毒性。6PPD与臭氧反应会生成更具毒性的6PPD-Q。为了研究这些污染物对生物体的全基因组影响，我们使用了Daphnia carinata作为研究物种。这种水蚤是澳大利亚淡水生态系统中的指示物种，同时也是一种成熟的生态毒理学模型。我们组装了一个近乎完整的（完整性超过98.8%）D. carinata染色体级基因组，并在6PPD和6PPD-Q浓度分别为10和50 μg/L的条件下，对其进行了整合转录组学和蛋白质组学分析。差异表达谱在蛋白质组学水平上更为明显。对于6PPD，转录组分析显示半乳糖/海藻糖代谢和ATP依赖性转运相关基因的表达增强，这与碳水化合物利用、能量分配和膜转运的变化一致。相比之下，6PPD-Q导致糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化、氨基酸代谢、外源物质生物降解以及氧化应激防御相关蛋白发生广泛变化，同时还涉及离子转运和几丁质重塑相关的蛋白质。6PPD-Q的转录组响应还突出了神经和感觉信号通路的作用。这些分子响应与能量代谢、氧化平衡、离子稳态和表皮更新密切相关，可能会影响生物体的蜕皮和繁殖行为，进而影响种群动态和生态系统功能。我们的研究结果表明，基于基因组的多组学方法在解析轮胎衍生污染物的作用机制方面具有价值，并强调了D. carinata作为监测和评估水环境中6PPD和6PPD-Q风险的理想物种的潜力。
引言
N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD）是一种广泛应用于轮胎工业中的抗氧化剂，用于防止橡胶降解并延长轮胎使用寿命[1][2][3]。随着轮胎磨损，含有6PPD的微粒会从胎面脱落并沉积在道路上，随后通过雨水流入周围水体[3][4][5][6]。在水生环境中，6PPD的半衰期较短（3.4-64.1小时），并与臭氧反应生成6PPD-醌（6PPD-Q），后者已被证实对某些水生生物具有毒性[8]。在鲑科鱼类中，即使在低于环境相关浓度（<12 μg/L）的情况下，6PPD-Q也会导致敏感物种（如银鲑Oncorhynchus kisutch、虹鳟O. mykiss和溪鳟Salvelinus fontinalis）的急性死亡[9][10]；最新研究使用商业标准和方法改进后，将银鲑幼鱼的LC50值下调至95 ng/L[9]。相比之下，其他鲑科鱼类（如北极红点鲑S. alpinus、大西洋鲑Salmo salar、褐鳟S. trutta）以及几种非鲑科鱼类（如斑马鱼Danio rerio、日本米鱼Oryzias latipes、白鲟Acipenser transmontanus、中国稀有鲦鱼Gobiocypris rarus）在类似浓度下几乎没有或完全没有急性致死效应[9][10][11][12][13][14]。这些物种间的差异表明了对6PPD-Q的敏感性存在差异，因此需要进一步了解其生态风险。
目前关于6PPD和6PPD-Q毒性的研究主要集中在鱼类上，而对水生无脊椎动物的影响研究尚不充分[2][9]。例如，Hiki等人[8]报告称，即使在6PPD的最大溶解度（约100 μg/L）下，6PPD-Q也不会对Daphnia magna或Hyalella azteca造成显著急性死亡。然而，仅通过观察急性麻痹或死亡现象可能无法全面反映暴露后的分子、生理和生殖方面的影响，尤其是对于在淡水食物网中起关键作用的无脊椎动物而言。因此，迫切需要开展机制研究，以探讨6PPD和6PPD-Q如何干扰与环境监测和风险评估相关的无脊椎动物物种的细胞通路和分子网络。
Daphnia属（水蚤）是淡水生态系统中的关键食草动物，因其对污染物的敏感性、快速的无性繁殖能力和明确的生物学特性而在生态毒理学研究中得到广泛应用[15]。使用Daphnia属于符合减少、替代和优化脊椎动物模型进行毒性测试的伦理指南[15][16][17][18]。此外，D. pulex和D. magna的参考基因组为将传统检测指标（繁殖、生长、行为）与分子响应和应激反应基因家族联系起来提供了有力支持[16][17][18][19][20]。然而，大多数基于基因组的研究集中在北半球的物种上，尽管其他Daphnia物种在当地生态系统中具有重要作用，但其在分子生态学方面的研究仍较为不足。
Daphnia carinata广泛分布于澳大利亚和东南亚地区，是许多淡水生态系统中的主要消费者和生态系统健康指标物种，已被用于生态毒理学研究[22][23][24][25]。以往的研究主要关注其繁殖和行为特征，如幼体产量、繁殖时间、游泳活动和摄食率[23][25][26]。但由于缺乏高质量的基因组序列，我们无法全面了解该物种在化学物质暴露下的全基因组分子响应，从而在转录组学和蛋白质组学层面对其应对新兴污染物（如6PPD和6PPD-Q）的能力了解有限。
在这项研究中，我们通过构建一个近乎完整的D. carinata染色体级基因组，利用这一基因组资源来研究其对6PPD和6PPD-Q的分子响应。我们结合了短读长测序、Hi-C组装技术和基因组注释方法，生成了一个高质量的参考基因组，并在6PPD和6PPD-Q浓度分别为10和50 μg/L的条件下进行了48小时暴露后的整合转录组学和蛋白质组学分析。通过分析差异表达、通路富集和酶类变化，我们发现了这些化合物和剂量对氧化应激响应、碳水化合物和能量代谢、离子转运及结构稳态过程的特异性影响，并提出了一组候选基因和蛋白质作为暴露的早期分子指标。这些数据首次实现了基于基因组的6PPD和6PPD-Q毒性的多组学评估，确立了D. carinata作为评估淡水生态系统中轮胎衍生污染物风险的理想模型。
研究片段
水蚤来源与鉴定
本研究中使用的Daphnia carinata最初于2002年从澳大利亚新南威尔士州环保局（NSW EPA）的生态毒理学中心获得，随后由CSIRO环境部在澳大利亚南澳大利亚州的Urrbrae进行培养。
水蚤培养条件
培养条件遵循经合组织（OECD）的指导原则[27][28]，温度维持在19 ± 1°C，pH值在7.6 ± 0.3之间。
结果与讨论
我们构建了一个高质量的D. carinata染色体级基因组，并在此基础上进行了转录组学和蛋白质组学分析，以研究该物种对两种关键环境污染物（6PPD及其氧化产物6PPD-Q）的全基因组响应。这种综合方法为深入研究提供了重要基础。
结论
通过构建高质量的染色体级基因组并结合转录组学和蛋白质组学分析，我们首次实现了基于基因组的6PPD和6PPD-醌（6PPD-Q）在D. carinata中的毒性评估。化学验证表明，直接添加的6PPD-Q在培养基中仍可检测到，而6PPD-Q在所有6PPD处理组中均无法检测到，这表明在我们所设定的中等硬度水体静态条件下，这两种物质代表了不同的作用机制。
CRediT作者贡献声明
汤姆·沃尔什（Tom Walsh）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、数据分析。
莱昂·考特（Leon Court）：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验设计。
冈詹·潘迪（Gunjan Pandey）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、监督、软件开发、方法学设计、数据分析、数据管理。
拉胡尔·拉内（Rahul Rane）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、数据分析。
坎达克尔·阿西夫·艾哈迈德（Khandaker Asif Ahmed）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
坎达克尔·阿西夫·艾哈迈德（Khandaker Asif Ahmed）和托马斯·阮（Thomas Nguyen）获得了CSIRO的博士后奖学金支持。我们感谢Graeme Batley博士对手稿的审阅和宝贵建议。
