《Journal of Virological Methods》：Development and application of a real-time RT-PCR assay for the specific detection of influenza D virus
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本研究基于PB1基因设计高特异性实时荧光RT-PCR检测方法，成功检测到河北省10个地区417份牛鼻拭子样本中33份（7.91%）流感D病毒阳性样本，HEF基因测序均属D/Yama2019谱系，核酸同源性98.7%-99.1%，为国内首次证实牛群中存在该病毒。
王金峰|李瑞文|刘丽萍|于洁石|李宁|季新成|杨月|孙晓霞|袁万哲|王建昌
石家庄海关技术中心，中国石家庄050051
摘要
自2011年D型流感病毒（IDV）首次从美国出现呼吸道疾病症状的猪身上分离出来以来，该病毒已在全球20多个国家的多种动物中被检测到，包括牛、猪、山羊、绵羊和骆驼。IDV已成为与牛呼吸道疾病综合症（BRDC）相关的重要病原体。本研究基于PB1基因的保守区域设计了特异性引物和TaqMan探针，开发了一种高特异性和高效实时RT-PCR检测方法（RT-qPCR）来检测IDV。RT-qPCR方法对IDV具有极好的特异性，且不会与其他常见的BRDC相关病原体发生交叉反应。使用体外转录的PB1 RNA作为模板，该方法的检测限为100个拷贝/反应。此外，该RT-qPCR方法在中国河北省10个不同地区收集的417份牛鼻拭子样本上进行了评估，时间跨度为2021年至2022年。结果显示，有33份样本（7.91%）对IDV呈阳性。在这33份阳性样本中扩增并测序了IDV的HEF基因，获得了10条HEF基因序列，均属于D/Yama2019谱系，核苷酸同源性在98.7%到99.1%之间。本研究成功开发了一种用于特异性和敏感检测IDV的RT-qPCR方法，并在牛鼻拭子样本上表现良好。同时，这也是首次在中国河北省的牛群中检测到IDV的存在。
引言
D型流感病毒（Influenza D virus, IDV）是流感病毒家族中的一个新成员，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）和Deltainfluenzavirus属。IDV于2011年4月首次从美国俄克拉荷马州一只出现流感样症状的猪身上分离出来（Hause等人，2013年）。随后，在2013年，IDV在美国多个州的牛身上也被分离出来，并于2016年8月被国际病毒分类委员会（ICTV）正式命名为D型流感病毒（Yu等人，2021年）。IDV基因组由七段负链单链RNA组成（Hause等人，2013年），这些RNA编码聚合酶基本蛋白1（PB1）、聚合酶基本蛋白2（PB2）、聚合酶酸性蛋白（P3）、独特的表面糖蛋白血凝素-酯酶融合蛋白（HEF）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M）和非结构蛋白（NS）。其中，PB1基因在IDV基因组中相对保守，常被用作分子生物学检测的目标基因（Hause等人，2013年；Faccini等人，2017年；Kishimoto等人，2017年）。相反，HEF基因是IDV基因组中变异最大的部分，主要用于系统发育分析。目前，根据HEF基因的序列，IDV菌株至少可以分为五个不同的谱系：D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019（Martin等人，2017年；Yesilbag等人，2022年）。现有数据表明，D/OK、D/660和D/CA2019是主要在欧洲和北美传播的IDV谱系（Huang等人，2021年；Yu等人，2021年），而D/Yama2016和D/Yama2019谱系主要分布在日本、中国和韩国等亚洲国家（Mekata等人，2018年；Hayakawa等人，2020年；Murakami等人，2020年；Yu等人，2022年；Lim等人，2023年）。在目前流行的五个IDV谱系中，D/OK谱系是全球报告最频繁的谱系（Yu等人，2022年）。IDV已在包括牛、猪、山羊、绵羊、骆驼、马、鹿和狗在内的多种动物中被检测到（Jiang等人，2014年；Salem等人，2017年；Snoeck等人，2018年；Oliva等人，2019年；Guan等人，2022年；Sreenivasan等人，2022年；Trombetta等人，2024年）。这种情况发生在多个国家，如中国、法国、日本和意大利。研究表明，牛是IDV的主要自然宿主和病毒储存库（Hause等人，2014年），IDV是牛呼吸道疾病综合症（BRDC）的主要病原体之一。
快速有效的IDV检测方法对于预防和控制IDV感染至关重要。目前，已经开发了几种传统的RT-PCR和实时RT-PCR检测方法（Hause等人，2013年；Faccini等人，2017年；Kishimoto等人，2017年）。尽管上述方法已被广泛用于IDV的检测，但在引物-探针设计中使用的参考菌株多样性存在明显不足。这一限制使得所开发的检测方法无法涵盖所有五个谱系的菌株序列。鉴于IDV菌株的多样性和广泛分布，确保所开发的检测方法能够有效检测所有谱系的IDV菌株至关重要。
在本研究中，我们基于PB1基因开发了一种针对五种不同谱系IDV菌株的RT-qPCR方法，并用该方法检测了从河北省10个不同地区收集的417份牛鼻拭子样本。
部分内容摘录
病毒、细菌菌株和临床样本
本研究中使用的D/Yama2019（D/bovine/CHN/JY3002/2022）和D/OK谱系病毒菌株（D/OK/P3/MOOK）由广东省农业科学院的于洁石教授提供。此外，还提供了牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞病毒（BRSV）、牛鼻病毒B型（BRVB）和牛副流感病毒3型（BPIV-3）的基因组RNA；以及牛疱疹病毒1型（BoHV-1）和牛腺病毒3型的基因组DNA。
RT-qPCR方法的优化
最终的RT-qPCR反应体系如下：12.5 μL的2 × PerfectStart? Probe One-Step qPCR SuperMix，0.5 μL的RT/RI酶混合液，每种引物1.6 μL（10 μmol/L），0.8 μL的探针（5 μmol/L），以及1 μL的体外转录RNA或2 μL的提取病毒RNA，用DEPC H2O调整最终体积至25 μL。反应条件为45 ℃加热5分钟，94 ℃加热30秒；然后进行40个循环，每个循环包括94 ℃加热5秒和56 ℃加热30秒（收集荧光信号）。讨论
IDV于2014年首次在中国山东省的牛群中被检测到。三个分离出的菌株被确认属于D/OK谱系（Jiang等人，2014年）。2021年至2022年间，在中国广州的一家屠宰场中，从健康的牛身上发现了10株属于D/Yama2019谱系（D/bovine/CHN/JY3001/2021）的IDV菌株（Yu等人，2022年）。进一步分析显示，这些IDV阳性的牛来自甘肃、内蒙古、安徽、山西、辽宁、宁夏和河北等地的农场。
未引用的参考文献
(Trombetta等人，2024年)
资助
本研究得到了海关总署研究计划（2023HK035）的支持。
作者声明
我们确认本手稿是原创作品，未曾发表过，也未被其他期刊考虑发表。所有作者均已审阅手稿，并同意其内容和提交给《病毒学方法杂志》（Journal of Virological Methods）。
CRediT作者贡献声明
杨月：方法学研究、数据分析。
孙晓霞：初稿撰写、数据管理。
袁万哲：资源获取、资金筹集。
王建昌：撰写、审稿与编辑、项目管理。
王金峰：初稿撰写、验证、方法学研究、数据分析、概念构思。
于洁石：验证。
刘丽萍：方法学研究、数据分析。
季新成：验证、资源协调。
李瑞文：验证、资源协调。
李宁：验证。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
