《Ecology and Evolution》：Untangling Sampling Bias From Lemur Dietary Specialization
ABSTRACT
识别野生动物食性特化的驱动因素对于理解营养相互作用和物种在环境中的功能角色至关重要。然而，采样偏差在营养相互作用研究中普遍存在，特别是在具有隐蔽物种的生物多样性热点地区。本研究旨在探讨采样偏差在调节功能性状对食性特化估计效应中的作用。通过分析狐猴-植物生态相互作用中的性状偏差，我们改进了观测狐猴食性丰富度的估计。首先，我们量化了植物及其与狐猴相互作用的采样不足情况。接着，通过比较三个负二项回归模型（预测因子包括：i）五个狐猴性状；ii）采样努力度；iii）性状与采样努力度组合），测试了采样努力度对性状预测因子估计效应的影响。最后评估了采样偏差对狐猴性状的影响，并考虑了这些中介效应对广义线性模型预测的不确定性。
1 Introduction
饮食多样性是生态和进化过程的基础。动物的食物物种数量和组成影响行为、进化和灭绝风险。因此，保护营养相互作用对维持全球生物多样性至关重要。然而，限制大规模生物多样性科学的主要缺陷之一是缺乏对生物相互作用的认识。营养相互作用仍然知之甚少，动物的食性特化——尤其是隐蔽物种——的表征很差。例如，生态相互作用数据的收集高度集中在北美和欧洲，因此系统性地忽视了全球生物多样性和灭绝热点。
某些物种的采样不足长期以来被认为是生态研究的基本问题。分类和地理偏差在动物生物多样性研究中普遍存在，热带地区尤其采样不足。生态相互作用的采样面临与物种采样类似的挑战；即使在采样努力度高的研究中，相互作用的不完整性仍然存在。饮食数据的文献汇编可以通过结合不同数据源部分克服采样不足，但不完整采样仍然是重要挑战。虽然通过稀有种外推方法预测食性丰富度在概念上很有吸引力，但当前饮食数据中固有的不确定性和采样偏差可能削弱此类分析的统计稳健性。
功能性状既驱动食性丰富度，也影响采样偏差。在营养相互作用网络中，消费者及其猎物的性状共同影响网络结构。例如，在中国西南部，大种子植物比小种子植物与食果动物的连接更紧密。大型动物倾向于取食具有较大果实的植物，这一过程称为“体型匹配”。然而，其他研究发现，虽然果实大小具有系统发育保守性，但与灵长类食物选择无关，突出了进化机制在食性多样性中的重要性。体型不匹配以及空间和时间不匹配可能导致生态网络中出现“禁止链接”，即物种无法相互作用。因此，生活史信息对于评估饮食数据采样的完整性至关重要。
功能性状也影响生态研究中的偏差模式。例如，在灵长类中，大型物种比小型物种得到更多研究。为了实现对食性特化的机制理解，必须区分功能性状对食性丰富度本身的影响与其对采样的影响。
表征饮食数据中的偏差和改进食性特化估计对于生物多样性高、隐蔽相互作用和保护威胁严重的地区尤为重要，例如马达加斯加。人为压力如森林砍伐威胁94%的现存狐猴和63%的特有树木灭绝。狐猴支系在五个科中包含111个物种，具有生态和功能多样性。约一半狐猴物种是已知的食果动物，作为马达加斯加的主要种子传播者，食果狐猴在植物群落动态和生物多样性维护中发挥关键作用。许多狐猴还通过捕食种子和取食叶子、树皮等与植物发生拮抗相互作用。约28%的狐猴，特别是小型夜行物种，已知消费无脊椎动物。此外，大多数（约60%）狐猴物种是夜行性的。
狐猴功能性状是狐猴-植物相互作用的关键组成部分，从生态网络连接到种子传播结果如萌发。与觅食行为和能量需求相关的狐猴性状可能影响食性特化。例如，与较小灵长类相比，大型灵长类需要更多能量，具有更强的获取食物资源能力，并消费更多低质量食物。较大的群体规模与哺乳动物觅食效率相关。虽然活动模式可能影响狐猴觅食能力，但大多数狐猴饮食研究在日行物种上进行。由于特化物种往往对环境变化的耐受性较差，保护状况也可能帮助解释狐猴食性特化。尽管马达加斯加具有丰富的狐猴-植物相互作用研究历史，但对马达加斯加独特生物多样性的知识空白仍然存在。特别是，最近研究强调狐猴-植物相互作用采样严重偏向某些地点和物种。
我们分析有采样偏差的狐猴及其食物植物的生态相互作用数据，以（i）通过稀有种外推估计饮食数据的采样完整性；（ii）评估采样中的性状偏差并计算这些偏差对食性丰富度广义线性模型预测的影响。我们预期，除了倾斜的采样不足外，基于性状的分类偏差影响我们估计物种食性丰富度。几个关键功能性状，特别是狐猴体型和活动模式，预计既驱动饮食数据收集的偏差，也驱动生物相互作用本身。稳健表征饮食数据中的性状偏差并将真实的性状预测信号与采样偏差效应分离，对于推进自然历史理解和指导采样方法具有价值。
2 Methods
2.1 Data
2.1.1 Lemur Dietary Data
我们使用来自狐猴食物植物数据库（LFP）的狐猴饮食数据。LFP是一个包含56个狐猴物种和599个植物属之间5420个观测相互作用的数据库，来自204项独立研究。在LFP中，58%的植物记录鉴定到种，42%鉴定到属。因此，遵循DeSisto和Herrera的方法，我们在属水平分析植物以解决数据集中植物分类分辨率低的问题。这导致最终数据集中包含55个狐猴物种和590个植物属。将植物记录聚合到属水平标准化了记录间的分类分辨率，减少了采样努力度如何影响估计植物丰富度分析中的偏差。然而，聚合到属水平可能掩盖如果更多植物鉴定到种水平可检测的生态细微差别。
2.1.2 Traits
我们编制了一个代表可能预测狐猴食性丰富度的形态、生活史和生态性状的狐猴性状组合。我们从Razafindratsima等人和IUCN收集了以下狐猴性状：体重、脑重、活动模式（夜行性或日行性/晨昏性）、饮食（食果性或其他）、妊娠长度、群体大小、栖息地（湿润、干燥或两者）、家域大小、产仔间隔和窝仔数。这些生活史性状可能通过能量需求、觅食行为和社会性影响狐猴食性特化。我们将日行性和晨昏性物种分组，因为两者在白天都有活动期，可能导致文献中对其相互作用的采样不足较少。如果一个物种有证据表明其饮食中包含果实，则被视为食果动物。我们还根据IUCN类别包括保护威胁状况，因为特化物种往往对环境变化的耐受性较差。保护威胁状况代表了未完全被其他测量性状捕获的复合因素——如栖息地特化、地理范围大小或人类压力。物种被分类为濒危（IUCN状况为濒危或极危）或不濒危（所有其他类别）进行分析。我们的分析是相关性的，不推断这些性状直接导致食性特化。
在55个狐猴物种中，这11个性状值的90%在文献中可用。我们使用以下方法估算剩余10%的缺失性状值以获得完整性状组合。考虑性状矩阵相关性和系统发育关系，我们使用funspace包估算缺失狐猴性状值。我们使用U.PhyloMaker包和Upham等人的哺乳动物巨树构建用于性状估算的55个狐猴物种系统发育树。所有分析在R版本4.3.1中进行。
分类采样努力度——或每个狐猴物种的采样努力度——定义为LFP中记录任何给定物种的观测数量（即LFP中记录给定物种的研究数量）。虽然该指标在未捕获活动模式或采样方法个体变异等因素方面有限，但它跨异质研究标准化并捕获研究关注度的变异。
2.2 Data Processing and Analyses
2.2.1 Sampling Completeness
我们使用Hill数的稀有种外推表征狐猴消费的植物属和狐猴-植物相互作用的采样完整性。我们使用基于样本量的稀有种外推曲线计算丰富度、香农多样性的指数和辛普森多样性的倒数及其相关95%置信区间。丰富度代表独特观测数量（植物属和饮食相互作用）。香农多样性是考虑丰富度和均匀度（个体分布均匀程度）的指数。辛普森多样性是考虑丰富度和优势度的指数，使其对稀有观测的敏感性低于香农多样性。我们使用iNEXT包评估植物属多样性，使用iNEXT.link包评估相互作用多样性。对于植物属，我们基于观测数量、研究数量和地点数量计算采样完整性。对于狐猴-植物相互作用，我们基于观测数量计算采样完整性，因为iNEXT.link与二元相互作用矩阵兼容，不与发生矩阵兼容。
2.2.2 Trait Dimension Reduction
我们对连续狐猴性状使用主成分分析（PCA）以减少预测模型中的相关变量数量，并识别解释所有狐猴物种最多变异的性状。体重、群体大小和窝仔数捕获了前四个主成分之间的主要变异模式，因此被选为连续预测因子。体重和脑大小都强烈加载到第一主成分上，且高度相关。因此，我们选择包括体重而非脑重，因为体重直接影响能量需求、消化形态（如肠道保留时间）和运动。群体大小和家域大小也类似地加载到主成分上；我们选择包括群体大小而非家域大小，因为灵长类社会性与改进的觅食效率、种间竞争能力和认知相关。虽然其他选择是可能的，但由于跨主成分的类似加载，我们相信它们将产生类似结果。
食果性和日行性是PCA坐标中显示个体聚类的仅有两个二元预测因子，即存在共享活动模式和饮食行为的狐猴聚类，可用于分析。此外，我们相信这些性状由于白天易于观察日行物种和研究对通过果实消费进行种子传播的兴趣而易受分类采样偏差影响。
2.2.3 Dispersion of Dietary Data
虽然泊松模型常用且定性地适用于生态数据，但必须检查过度离散假设，即方差不应显著超过数据均值。我们通过拟合仅截距泊松模型（在n=53狐猴上，排除异常值）并计算Pearsonχ2离散统计量和偏差除以残差自由度评估计数响应食性丰富度的离散。具体地，Pearsonχ2使用来自拟合泊松模型的Pearson残差计算，离散定义为Pearsonχ2；基于偏差的离散计算为模型偏差超过。
对于我们的数据，Pearson离散和基于偏差的离散均为37，表明相对于泊松假设的极端过度离散。因此，我们使用容纳额外变异的负二项模型。
2.2.4 Dietary Richness Negative Binomial Model
由于已知采样偏差，我们从模型中移除Indri indri和Lemur catta物种。两种都是引人注目的旗舰物种，一直是众多生态和行为研究的焦点。
所有模型的因变量是观测狐猴食性丰富度，即狐猴物种食用的植物数量。由于它在我们的数据中由过度离散、右偏、重尾分布表示，我们选择负二项广义线性模型框架进行预测。对于所有模型，使用Akaike信息准则（AIC）和伪R2（也称为McFadden's R2，因为无法计算负二项回归模型的R平方）描述跨运行的拟合优度。McFadden's R2定义为，其中和分别是拟合模型和零模型的似然。它量化拟合模型与零模型的对数似然比例改进；通常比线性回归的普通R2小得多，应解释为解释力的比较度量（值接近0表示相对零模型改进很小，值接近1表示更大改进），而非解释方差分数。对于所有三个模型，我们通过从原始数据集中重复重采样1000次（有放回）53个物种观测并重新拟合每个模型到这些自助样本执行非参数案例自助法，以获得AIC和伪R2的经验分布。为了模型比较的稳健性和可解释性，我们计算所有三个负二项模型的ΔAIC和Akaike权重（wAIC）。
我们使用方法矩估计初始化负二项离散参数（θ），对于我们的食性丰富度数据（均值=43.79，方差=1635.63）给出θ≈1.205。θ通过参数化负二项方差，因此该值表示 substantial extra-Poisson variance，并用作起始值以帮助模型收敛。
3 Results
3.1 Sampling Completeness
狐猴饮食数据文献中植物采样不足。狐猴消费的植物属观测丰富度为590（按观测数量外推=668-775），香农多样性的指数为259（269-288），辛普森多样性的倒数为127（122-139）。按研究数量外推的植物属丰富度为707-815，按地点数量外推为731-862。因此，植物属采样相对同等受观测数量、研究数量和地点数量限制。
文献中可能缺失高达45%的狐猴物种和植物属之间的饮食数据。观测相互作用丰富度为2614（按观测数量外推=5177-5800），香农多样性的指数为1807（3008-3258），辛普森多样性的倒数为1084（1265-1471）。相互作用辛普森多样性比丰富度或香农多样性采样更好，表明稀有相互作用可能特别采样不足。
3.2 Predictors of Dietary Richness
仅含采样努力度预测因子的模型往往具有最低AIC分数，表明比狐猴性状模型更好的模型拟合。基于伪R2方法，采样努力度模型仅略被包含五个狐猴性状和采样努力度作为预测因子的模型超越。狐猴性状不是食性丰富度的统计显著预测因子；采样努力度承担全部解释权重。性状和采样模型的较大伪R2分数可能归因于模型中包含的较多预测因子。
wAIC为0.989，采样努力度模型在我们的候选集中比狐猴性状和采样模型（wAIC=0.011）大约99倍更可能是最佳近似模型。仅包含狐猴性状的模型获得可忽略支持（wAIC=2.00e-05）。这些结果对包含异常值——Indri indri和Lemur catta稳健。
三个模型系数的比较揭示了食果性和日行性变量影响的小偏移。当采样努力度作为预测因子引入时，它成为观测食性丰富度的最关键决定因素，而除食果性外的狐猴性状不是狐猴食性丰富度的显著预测因子。
3.3 Biased Prediction
当我们仅使用五个狐猴性状预测食性丰富度时，饮食和活动模式成为仅有的具有非零中位数估计的潜在预测因子。比较五个性状模型的观测与预测食性丰富度，预测值分层为三个水平：日行食果狐猴最高，主要为夜行食果狐猴的中间水平，和夜行非食果物种的最低水平。包括采样努力度作为预测因子轻微校正了这种隐式分层偏差。
4 Discussion
总体，我们的结果强烈表明采样偏差在当前狐猴饮食数据中发挥过大作用。采样不足可能导致缺失高达45%的狐猴物种和植物属之间的饮食相互作用。此外，采样努力度仍然是观测饮食行为的最重要预测因子：仅包含采样努力度的模型获得不成比例的高支持，由Akaike模型权重量化。具体地，在排除异常值后，该模型比包含狐猴性状和采样作为预测因子的模型大约99倍更可能。即使保留异常值，仅采样努力度模型仍然获得比仅五个性状模型 substantially greater support。观测的采样偏差可能主要归因于先前识别的生态野外偏差，导致日行狐猴相对于夜行狐猴和食果狐猴相对于非食果狐猴的不成比例观察。这些发现表明可能存在需要进一步分析的中介效应。
4.1 Sampling Effect
采样努力度可能中介某些功能性状对食性丰富度的效应。因此，未能考虑采样努力度导致对功能性状在食性多样性中生物学作用的不准确理解。当采样努力度从我们的食性丰富度模型中排除时，狐猴饮食 guild（物种是否为食果动物）的重要性，特别是活动模式（日行或夜行）被高估，突出表明狐猴饮食研究偏向食果、日行狐猴。值得注意的是，我们的负二项模型结果表明食性丰富度与狐猴是日行或夜行无显著相关。虽然夜行狐猴在生态研究中通常比日行狐猴代表不足，但它们发挥重要的生态功能如种子传播。与在新热带灵长类进行的研究不同，体重与食性丰富度无关。
4.2 Phylogenetic Insight
生物性状通常显示系统发育信号。因此，解耦任何观测的基于性状的关系是由性状本身还是共享进化历史和系统发育保守性引起具有挑战性。许多解释物种数据系统发育非独立性的常见频率论方法不支持负二项或泊松分布。因此，我们使用MCMCglmm解释狐猴系统发育关系。这些模型通常支持主要分析结果。虽然平均Pagel's λ值表明狐猴食性丰富度中存在中度系统发育信号，但高不确定性意味着我们不能排除无系统发育信号。
考虑饮食研究中的系统发育效应可能揭示生物学重要性状。例如，我们的解释采样努力度的系统发育分析表明群体大小可能正向预测狐猴食性丰富度（边际显著）。哺乳动物中的社会性改进觅食效率和种间竞争能力。因此，当理想食物资源在环境中斑块化分布时，较大群体中的狐猴可能能够更好地获取和垄断这些资源。确实，狐猴群体大小预测社会认知，来自较大群体大小的Lemur catta通过访问有利栖息地获得觅食优势。然而，群体大小之间存在竞争权衡。例如，当食物资源稀缺时，大群体中的狐猴表现出高压力水平，表明较大群体大小固有的种内食物竞争也可能对适应性产生负面后果。为了改进对食性特化与生活史性状如群体大小之间关系的理解，我们倡导未来研究进一步调查饮食生态中的系统发育保守性。
4.3 Variable Mediation Effects
与其他生态研究一起，我们的分析表明食果性和日行性等性状偏差采样。因此，当作为狐猴食性丰富度的预测因子处理时，采样努力度可能作为这些性状对真实饮食行为的中介混淆因子。我们使用可用软件进行了几种中介分析，但每种都有显著注意事项。由于广泛使用的mediate包不支持负二项模型，我们通过泊松模型建模中介效应。虽然结果支持我们的中介假设，但它们未解释数据的严重过度离散，因此结果可能过度自信。maczic包允许我们通过提供其截距和系数部署负二项中介和结果模型，但其先验默认标准正态分布且非常非信息性。虽然先验默认选择可理解，但无法基于已知狐猴性状值构建更多信息先验引入非常宽的置信区间和大不确定性。我们仅观察到4%-5%的模拟中检测到中介效应，但我们相信这可能是由于先验不灵活性和偏差。构建能够分析具有不同分布的各种协变量的严重过度离散数据的中介效应的稳健软件超出本文范围，我们推荐进一步研究采样努力度的中介现象。我们的模型涉及假设，结果解释应谨慎处理。然而，这里考虑的不同统计分析一致指向采样努力度在中介功能性状——特别是食果性——预测食性丰富度中发挥作用。
4.4 Future Directions and Conservation Implications
二部分狐猴-植物网络帮助我们探索和分析营养相互作用的生态进化机制和生态后果。表征偏差来源是改进网络级指标的关键步骤，但我们的分析未识别哪些链接缺失。因此，未来对狐猴-植物相互作用的研究应采用新的链接预测技术，稳健解释采样偏差。除了解决空间、分类和基于性状的偏差外，同等重要的是认识生物多样性数据中普遍存在的时间偏差。因此，调查饮食数据中的物候偏差代表关键前进步骤。通过系统解释各种类型的采样偏差，我们将获得对物种生态作用的更深入见解，揭示热带生态系统中驱动生态相互作用的基本机制。
对食性特化的有偏差理解可能限制有效保护。例如，虽然DeSisto和Herrera解释采样努力度以识别植物灭绝对狐猴种群的潜在后果，但额外的饮食数据可能改进这些估计。饮食数据中的空白可能阻止更完整理解其他保护问题对狐猴觅食行为和森林生态系统功能的影响。例如，狐猴已知使用入侵物种作为栖息地，以及取食和传播入侵植物。狐猴-植物相互作用数据不成比例集中在特定地点和物种。例如，虽然马达加斯加拥有98个陆地保护区，但狐猴饮食研究主要集中在水土设施如Centre ValBio促进研究的Ranomafana国家公园。将研究野外站扩展到额外地点可能增强大规模生物多样性研究，同时改进保护工作。稀有种外推曲线表明我们远未充分采样所有可能地点的狐猴饮食。因此，为了改进狐猴饮食数据集的完整性，我们相信优先在代表不足地点进行实证研究至关重要。文献中经常被忽视的社区管理保护区是当前未来狐猴-植物相互作用研究的有希望地点。此外，来自其他地区的证据，如对巴西不同分类群的研究，突出了生物多样性研究中空间偏差采样的普遍问题。解决空间采样偏差对于饮食数据尤为重要，其中偏差可能跨营养级复合。保护管理计划中低估或忽视的取食区域可能导致对提供必需食物资源给濒危物种如狐猴的栖息地保护不足。
5 Conclusions
我们的研究强调了采样偏差对理解狐猴食性特化和营养相互作用的普遍影响。基于稀有种外推多样性分析和食性丰富度的基于性状建模，我们发现采样努力度可能对活动模式和饮食具有某些中介效应，导致对这些功能性状解释食性丰富度预测力的不当或不足估计。采样偏差也可能掩盖与食性丰富度具有生态显著关系的其他功能性状的显著性。这些发现强调需要解决分类、地理和时间偏差的综合数据收集策略。采样夜行和非食果狐猴，将研究工作扩展到代表不足地点，特别是社区管理保护区，并进一步调查潜在物候偏差将改进数据完整性和从中得出的生态见解。此类方法对于准确估计功能性状对食性丰富度的效应以及推进跨热带生态系统的有效采样方法至关重要。
