《Environmental Microbiology》：Millimetre-Scale Stratification of Microbial Communities in Hydrothermal Sediments
摘要
解析在陡峭的热量和地球化学梯度环境中微生物种群的空间组织仍然是环境生物地球化学中的一个挑战。传统的分子生物标志物或基于基因的方法通常需要大量均质化的样品，限制了其描绘空间结构化的微生物生态系统的能力，而关键的微生物过程发生在毫米尺度上。为了克服这些限制，我们应用高分辨率质谱成像（MSI）技术，对来自以极端温度和尖锐地球化学梯度著称的瓜伊马斯盆地Cathedral Hill垫状复合体的一个11.5厘米长的沉积物剖面进行了分析。微米级的空间分辨率揭示了一个细微的脂质组分区，该区紧密压缩在沉积物-水界面以下一个狭窄的5厘米段内。表层（1.1厘米bsf以上）承载的分子模式主要受相反的氧气和硫化物梯度影响，随后近乎无缝地过渡到以厌氧甲烷氧化古菌（ANME）和硫酸盐还原菌（SRB）为主的无氧区。在更深处，指示活跃微生物群落的分子信号除集中在硅质结核内的多种可能与ANME和SRB相关的脂质外，均低于检测限。脂质分带的急剧转变暗示了在强烈的流体流动和动态地球化学梯度下，持久的氧化还原带和具有韧性的微生物生态位。
1 引言
热液沉积物是高度动态的系统，由强烈的流体流动和毫米尺度上展开的陡峭物理化学梯度所塑造。这些条件共同创造了一个复杂的生物地球化学栖息地，支持着多样的微生物种群，并促进了独特生态位的发展。然而，解析这些微生物群落的精细空间组织仍然是一个挑战。传统的基于基因和分子生物标志物的方法通常依赖于厘米大小的均质化样品，这掩盖了可能跨越陡峭地球化学梯度发生的微生物群落的微妙空间分布。因此，目前尚不清楚热液环境中的陡峭氧化还原梯度是促进了不同微生物种群的显著深度分层，还是任何微生物组织都被强烈波动的流体流动所干扰，导致功能多样的微生物可能共存的更均匀分布。
本研究使用来自加利福尼亚湾内的瓜伊马斯盆地热液沉积物作为高分辨率研究的天然实验室。这个年轻的裂谷盆地由强烈的地热活动和热通量所塑造，这是由热的辉绿岩岩床侵入沉积基质所驱动的。极端热量与厚达500米的富含有机质沉积盖层的结合，创造了独特的热量和地球化学环境，其中热液流体异常富含甲烷、烃类、有机酸、氢气、硫化物和氨。这些强还原性热液流体与海水衍生的电子受体（如氧气、硝酸盐或硫酸盐）相互作用，在表层沉积物中维持了代谢多样性广泛的微生物种群。由于跨越毫米到厘米尺度的陡峭氧化还原和温度梯度，驱动诸如好氧硫氧化、硫酸盐还原、产甲烷作用和厌氧甲烷氧化（AOM）等过程的多种嗜温和嗜热微生物群落被压缩到一个狭窄的近地表区域。
相比之下，瓜伊马斯盆地传统的脂质生物标志物研究通常依赖于在厘米间隔上收集的均质化样品，限制了其解析微生物群落任何精细尺度变化的能力。为了克服空间分辨率的这些限制，一种称为基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）的先进技术已被环境科学采纳。MALDI-MSI可以通过从未受干扰的样品上的微米尺寸点生成质谱，解锁关于生物分子精细空间分布的先前无法获取的信息。在过去的十年中，MALDI-MSI为从精细分层的微生物垫到层状海洋沉积物等多种样品中的生物标志物定位提供了见解。
在本研究中，我们应用了一种非靶向的MALDI-MSI工作流程，来捕获从瓜伊马斯盆地热液活动的Cathedral Hill垫状复合体获取的沉积物岩心中的广泛脂质生物标志物特征。通过利用非负矩阵分解（NMF），我们旨在识别具有独特空间模式的分子信号，这些信号反映了这种热液环境特有的陡峭氧化还原梯度下微生物群落的分层。通过这种方法，我们为在极端热量和地球化学梯度下代谢不同的微生物群落的氧化还原依赖性分层提供了前所未有的见解。
2 材料与方法
2.1 研究地点和地球化学分析
沉积物岩心5000-9是在AT42-05航次期间，由阿尔文号潜水器在Cathedral Hill垫状复合体采集的。该岩心取自一个热液热点，其特征是密集生长着橙色贝日阿托菌科垫。相邻点的温度传感器测量显示，热梯度从5厘米bsf处的33°C上升到10厘米bsf处的69°C，最后在20厘米bsf处达到86°C。岩心回收后被冷冻并在-20°C下保存直至分析。用于氧气、H2S和pH微传感器测量的平行岩心（5000-3）在回收后2小时内在船上进行。
总有机碳（TOC）、总氮（TN）、稳定碳和氮同位素组成（δ13C和δ15N）从岩心5000-9以1厘米间隔测定。
2.2 MALDI-MSI的样品制备
由于冷冻岩心含水量高，解冻风险导致结构破坏，因此采用了一种替代方法。冷冻的岩心使用消毒的锯子切开，沿着整个岩心长度切割了两个平行的沉积物截面。一个截面用于常规脂质生物标志物分析，另一个用于MALDI-MSI。用于MALDI-MSI的样品被切割成两段，然后 freeze-dried 并小心地嵌入5%明胶和2%羧甲基纤维素（CMC）的混合物中。包埋的样品在-20°C下冷冻，用于冷冻切片，使用冷冻切片机切割100微米厚的沉积物切片。沉积物切片被安装到镀有氧化铟锡（ITO）的玻璃载玻片上。
2.3 基质应用
选择了两种实验方法进行MSI，每种方法使用不同的MALDI基质以覆盖广泛的化合物类别。基质包括溶解在70:30乙腈/水（ACN/H2O）中的10 mg/mL 1,5-二氨基萘（1,5-DAN）和10 mg/mL 2,5-二羟基苯甲酸（2,5-DHB），使用HTX TM-Sprayer进行喷涂。
2.4 MALDI-MSI
分子生物标志物的MSI在连接MALDI离子源的7T solariX XR FTICR-MS上进行。测量在m/z150至1000的分析质量窗口内进行。所有测量均在CASI（连续累积选定离子）模式下进行。分析物检测分为五个CASI窗口。对于每个MALDI基质，在三个沉积物切片上进行测量。使用交替点方法最大化从同一测量区域生成数据。
使用1,5-DAN基质的MALDI-MSI在负极性下进行，而使用2,5-DHB涂层的样品在正离子模式下测量。激光设置经过调整以获得最佳信号强度。使用FlexImaging进行MALDI-MSI，生成数千个个体光谱。原始数据在DataAnalysis 5.0中进行初步预处理，包括锁质量校准和信噪比（SNR）过滤。
2.5 非靶向数据挖掘工作流程
MSI数据集以纯文本文件形式输入非靶向数据挖掘工作流程。首先对峰强度进行归一化。应用分箱核密度估计（KDE）进行峰m/z对齐，仅保留密度曲线上突出度大于0.01的峰。此外，排除在样品区域内具有高稀疏性的分子特征。
2.6 数据清理
基质涂层会引入许多与沉积物样品无关的高强度离子。为了从下游分析中排除这些信号，利用了样品制备过程中留下的测量区域内的空隙区域。 disproportionately 集中在空隙区域内的峰被排除。
2.7 分子指纹识别
随后应用NMF来识别有意义的分子特征。NMF执行降维，允许我们提取共现的离子组，这些离子组代表MSI数据集中的潜在分子模式（组分）。为了NMF的噪声降低，将TIC归一化的数据集划分为空间区域，并计算每个m/z在内的平均丰度。在应用NMF之前，使用MaxAbsScaler对数据进行缩放。通过迭代最小化重构误差来确定NMF的最佳组分数量。然后，NMF将数据集分解为一个特征矩阵和一个空间矩阵。为了可视化已识别组分的空间分布，为每个组分创建了加权平均离子图像。
2.8 脂质提取和UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS
对于脂质提取，从平行于MALDI-MSI专用截面的推管岩心5000-9收集沉积物。样品以2厘米深度间隔采集。脂质提取物按照改良的Bligh & Dyer方案制备。总脂质提取物（TLE）在温和氮气流下干燥并储存于-20°C直至分析。
TLE的等分部分通过反相超高效液相色谱（RP-UHPLC）与电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）联用进行分析。色谱分离使用Acquity UPLC BEH C18柱实现。RP-UHPLC系统与Bruker maXis超高分辩率四极杆飞行时间质谱仪（UHR-qToF）耦合，该谱仪包含一个ESI接口。光谱采集在正离子模式下进行，跨越m/z50-2000的范围。脂质鉴定基于保留时间模式、精确的m/z和特征性MS/MS碎片。
2.9 微X射线荧光光谱（μXRF）
使用配备Rh源的M4 Tornado系统对模拟的100微米厚沉积物切片进行元素 mapping。μXRF光谱在真空下在一个循环中采集。基于相对计数强度对元素贡献进行去卷积和量化，用于空间 mapping。
3 结果与讨论
3.1 Cathedral Hill沉积物的地球化学背景
Cathedral Hill沉积物岩心（5000-9）的地球化学和热框架为讨论这种独特环境中氧化还原依赖的微生物活动和生物地球化学分带提供了基础。Cathedral Hill垫状复合体由于其异常高的有机质含量、急剧变化的氧化还原条件及其极端的热体制，一直是研究热液活动地点生物地球化学过程的热门目标。值得注意的是，TOC值在表层沉积物中高达4.8%，在整个岩心中保持在1.7%以上。从假定沉积物表面的底层水温约3°C开始，相邻岩心5000-9的单点温度传感器测量揭示了一个陡峭的热梯度。
图中所示的地球化学数据突出了沉积物内动态的氧化还原转变，这些数据来自邻近岩心5000-3（距岩心5000-9约10-20厘米内）的船上微剖面分析（步长250微米）。O2浓度在沉积物-水界面以下下降至约2 μM，低氧水平（0.3-1 μM）一直持续到约1厘米bsf。互补的微剖面分析显示，总硫化物在1厘米bsf以上的表层区域急剧下降至不可检测的水平，这表明存在活跃的好氧硫氧化群落。
孔隙水SO42?浓度在约5厘米bsf内显著下降至近乎耗尽，而H2S水平同时增加，指示异化硫酸盐还原。
包埋沉积物的冷冻切片显示，在约3.5-5.5厘米bsf处有一个离散的浅色硅质结核。另一个具有明显垂直分布的元素是钡，其在表层沉积物中显示出斑点状图案。这种分散的分布与细分布的重晶石（BaSO4）沉淀物的存在一致。
3.2 分子指纹
MALDI-MSI数据使用两种不同的基质在正和负离子模式下获取。为了获得全面和高分辨率的分子数据，使用CASI功能在五个m/z范围内进行测量。总共从岩心5000-9的11.5厘米长沉积物段获取了344,904个质谱。经过峰挑选后，获得了一个包含64,667个分子特征的组合数据集。随后的数据过滤，排除了基质相关信号和低丰度峰，将数据集减少到11,819个特征。NMF分析随后揭示了不同的分子分布模式，以下称为NMF组分。
这些NMF组分构成了以下讨论沿向下剖面具有生物地球化学意义的分子特征的基础。NMF组分与生物地球化学分区之间的一致性表明，脂质与其积累的环境（无论是生物还是非生物过程）之间存在密切联系。通常观察到两种根本不同类型的空间模式。首先，几个组分具有尖锐的垂直转变，让人联想到热液沉积物典型的陡峭氧化还原梯度。我们解释这些以突然且看似相互的转变为特征的分子分布模式，是沉积物内局部化、氧化还原驱动的微生物活动的指标。相比之下，其他分子指纹显示出更均匀的分布或逐渐向下或向上的趋势。这些更平滑的模式更符合潜在的水柱来源信号的逐渐降解或持久存在的难降解有机分子。
3.3 表层沉积物中的分子分布模式
为了研究推测与氧气可用性相关的分子信号，我们提取了空间集中在表层附近的特征。其中有三个具有相对高峰强度的离子被选中，作为表层区域内观察到的独特分子模式的例证。
分子离子m/z858.4658逐渐增加，直到在低氧带内达到最大强度，然后在1.1厘米深度处瞬间消失。具有这种分布的额外离子如图所示。这些独特的分子指纹与海水衍生的电子受体（如氧气和硝酸盐）扩散到表层沉积物中是一致的。尽管无法确定这些化合物的明确来源，但它们尖锐的、深度受限的出现与氧气和/或硝酸盐的可用性一致，并将其与沉积物-水界面附近活跃的氧化还原驱动过程联系起来。
表层沉积物有一个非常狭窄的区域，就在沉积物-水界面以下0.2-0.3厘米处，承载着几个未鉴定的化合物，以m/z379.2554为代表。这些分子位于表面以下几毫米处氧气迅速下降的区域，暗示严格好氧的微生物类群是潜在来源。这种空间模式通过m/z618.4715在2-3毫米深度处的近乎互补的出现得到进一步强调，从那里它向还原区延伸了几厘米更深。互补的UHPLC/HRMS脂质数据表明该化合物是一种磺酸脂（SL），可能是SL 17:0;O/17:0;O。化能有机异养的拟杆菌门成员是SLs最常见的生产者。海洋沉积物是拟杆菌门的典型栖息地。Ramírez等人最近通过16S rRNA基因扩增子序列变体在邻近沉积物岩心（5000-11）中检测到拟杆菌门，注意到其向下减少的趋势与岩心上部7厘米内的最高丰度相当。类水平组成表明厌氧和发酵的拟杆菌纲成员占主导地位。它们的厌氧代谢与SL在沉积物-水界面附近离散的富氧区内的缺失是一致的。
有趣的是，由m/z858.4658和暂定鉴定的SL 17:0;O/17:0;O代表的生物特征在低氧带内有一些空间重叠。虽然m/z858.4658可能反映了硫氧化细菌或其他依赖氧气和/或硝酸盐的细菌类群，但磺酸脂更可能指示发酵的拟杆菌门，可能是厌氧的拟杆菌纲。它们部分重叠的空间分布强调了代谢不同的微生物群落在小空间尺度上的共定位。
3.4 缺氧沉积物中的分子分布模式
总共有77个额外的分子特征与向更深、缺氧沉积层的转变相关。选择了六个具有高强度的特征来覆盖广泛的脂质种类，包括古菌脂质sn-2-羟基古菌醇（OH-AR）、磷脂酰肌醇羟基古菌醇（PI-OH-AR）和磷脂酰甘油羟基古菌醇（PG-OH-AR），细菌脂质细菌藿烷四醇环醇醚（BHT-CE）和古菌镍四吡咯辅因子F430。还包括一个未鉴定的化合物m/z897.4768，因为它异常明确的上边界和下边界，为 distinct 分子分带提供了额外证据。
图中所有六个分子特征在大约1厘米bsf处的突然和显著出现标志着一个显著的转变，并推测反映了一个稳定的缺氧区的开始。当叠加两种化合物的向下剖面时，一个跨度小于3毫米、重叠最少的转变变得明显，这意味着两个代谢不同的微生物群落在这个过渡带内共存。
缺氧区内最突出的脂质与厌氧过程密切相关。OH-AR、PI-OH-AR和PG-OH-AR是厌氧甲烷氧化古菌（ANME）的成熟生物标志物，特别是ANME-2支系，并已在富含甲烷的热液环境中反复报道。垂直分布与将ANME-2置于表层和温带沉积层内的甲基辅酶M还原酶α亚基（mcrA）基因调查和16S rRNA分析结果一致。对AOM的额外支持是辅因子F430的存在，它是关键酶MCR的辅基，分别在产甲烷作用和甲烷氧化中催化甲基到甲烷和甲烷到甲基的转化。总之，这种生物标志物库存提供了强有力的证据，表明由ANME-2介导的AOM集中在一个约2厘米的 distinct 带内，与上覆的好氧过程很好地分离，除了在1厘米bsf处有轻微的重叠。
除了典型的AOM生物标志物，我们还检测到一种细菌藿烷多醇（BHP），基于互补UHPLC/HRMS数据中的特征性碎片模式，暂注释为细菌藿烷四醇环醇醚（BHT-CE）。考虑到最近在附近热液沉积物岩心中检测到不寻常且结构多样的藿类化合物，不稳定的、高度官能化的BHT-CE可能代表了那些推测热蚀变分子的重要微生物前体。尽管BHT-CE在许多环境中被普遍检测到，但其 distinct 的空间分布缩小了其潜在的微生物起源。BHT-CE在缺氧区内的受限出现强烈暗示了厌氧微生物来源，使得典型的生产者，如好氧的甲基营养型和甲烷营养型细菌，不太可能是贡献者。相反，地杆菌属物种是此环境中BHT-CE的可能来源。这些厌氧细菌在缺氧、富含金属和烃类的环境中特别普遍，这些条件与瓜伊马斯盆地发现的条件惊人地相似。值得注意的是，BHT-CE被发现是异化金属和硫还原的地杆菌硫还原菌和金属还原地杆菌合成的主要复合BHP，支持地杆菌属作为瓜伊马斯盆地缺氧沉积物中BHT-CE的潜在来源。
由于并非所有特征都能获得互补的UHPLC/HRMS/MS光谱，MALDI-MSI中的化合物鉴定构成了重大挑战。尽管具有高质量分辨率和精确度，许多特征，特别是在较高m/z范围内的特征，仍然难以捉摸。一个这样的特征是m/z897.4768，它在1到2厘米bsf之间表现出异常高的强度，具有惊人明确的上边界和下边界。m/z897.4768与已建立的AOM生物标志物（如PG-OH-AR）的共现表明与ANME-2古菌或其相关的互养细菌伙伴有密切联系。该分子在该区域上下方的突然耗尽表明其具有高度不稳定的结构，与其生产者的空间分布紧密相关。
最后，生物特征显著集中在沉积物-水界面以下约3厘米的薄层内（不包括与硅质结核相关的那些），这很可能是由极端的热体制驱动的。尽管我们承认在沉积物更深处存在活跃的嗜热微生物生命，但我们的结果仍然强调了温带表层沉积物（<35°C）是这个热液塑造生态系统中微生物活动的主要热点。
总之，即使在岩心最上部4厘米内，MALDI-MSI也揭示了显著且清晰定义的分子转变，指示了沉积物内深度受限的、氧化还原敏感的微生物过程。这些发现最初似乎与Engelen等人使用高分辨率DGGE方法报告的更渐进的微生物变化相矛盾。然而，正如Engelen等人已经强调的，瓜伊马斯盆地受热液影响的沉积物表现出高度异质的精细地形，其中通道、流体流动或气袋阻碍了微生物群落形成完美的水平层。在他们的DGGE方法中，他们以2毫米间隔对整个岩心横截面进行采样，整合了相对较大区域的信息。相比之下，MALDI-MSI是在100微米厚的切片上进行的，专注于更局部的尺度。因此，在MALDI-MSI中看起来尖锐的转变，当平均到岩心横截面时可能看起来是渐进的。这通过分子分带略微倾斜的外观（在PI-OH-AR中观察得最好）进一步说明。此外，我们沉积物中嵌入的硅质结核可能代表了一个额外的促成因素，因为它可能局部减缓了热液通量，潜在地允许更 distinct 的好氧、低氧和缺氧区发展。因此，这两组数据并非矛盾，而是为这些高度异质的环境提供了互补的见解。
3.5 硅沉淀物中的分子分布模式
有趣的是，几个分子信号在空间上与硅质结核相关。虽然一些脂质似乎只出现在结核的边界内，如m/z679.5499和二醇甘油脂PE-DEG-C34:2和PI-DEG-C34:2，但其他脂质则延伸出去，并且在缺氧区（1-3厘米bsf）也很丰富，BHT-CE和OH-AR就是最好的例子。脂质注释得到了分离的硅质结核的互补UHPLC/HRMS分析的支持。
硅似乎要么作为一个与周围沉积物中微生物生态位不同的微生物定殖热点，要么作为一个介导特定生物分子保存的基质。完整的极性脂质（IP
