《Ecology and Evolution》：Skeleton Precedes Polyp: Visualization of Structural Changes During Coral Growth in Montipora capricornis
1 引言
珊瑚礁是生物多样性热点，也是抵御海岸侵蚀的自然屏障，然而它们正面临着来自气候变化（包括海洋酸化和变暖）的日益严重的威胁。保护石珊瑚（Scleractinian corals）的生长和造礁能力对于生态系统恢复力至关重要。石珊瑚的骨架由文石（aragonite，一种碳酸钙的多晶型物）构成，为珊瑚礁的形成提供结构支持。因此，生物矿化（biomineralization）作为珊瑚生态学的基本过程，直接影响珊瑚生长，并在应对珊瑚礁恢复相关挑战中起着关键作用。它为了解珊瑚如何应对海洋酸化和海温上升等环境变化提供了基础。石珊瑚通过无性出芽（asexual budding）进行繁殖，这一过程通过向现有群体添加新的珊瑚虫（polyp）而在群体生长中发挥关键作用。
为了进一步理解调控珊瑚生长的过程，最近的基因组学研究已经确定了参与碳酸钙沉积的关键基因和蛋白质。这些包括珊瑚骨架基质蛋白（coral skeletal matrix proteins）、珊瑚富酸蛋白（coral acid-rich proteins）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases），它们都参与珊瑚骨架的形成。结合相关的成像研究，这些基因组发现可以增强我们对珊瑚发育中关键生长过程的理解。尽管对珊瑚生长的分子和遗传机制已投入大量关注，但在视觉上捕捉所涉及的动态过程方面仍然有限，其中生物矿化和出芽机制仍然知之甚少。除了这些分子和基因组学视角外，关于参与珊瑚虫出芽的软组织的详细解剖学描述，例如出芽期间共肉（coenosarc）及相关器官的位置和变形，仍然匮乏。大多数可用信息是从骨骼结构或低分辨率表面成像间接推断而来，而非来自原位组织学或三维组织重建。先前的形态学研究主要集中于矿物骨架和管道网络，仅对潜在的软组织动力学提供了间接约束。现有的成像工作主要突出了珊瑚的结构多样性，为种间差异、自我修复机制和物种进化研究提供了有力证据，但对驱动骨架生长的实时软组织过程的洞察力要少得多。
为了解决这些挑战，研究人员采用了数字图像处理技术来可视化和检测珊瑚群体表面珊瑚虫和组织的细微运动。这种方法为理解珊瑚生长和珊瑚组织动态运动的基本生物学和物理功能提供了关键见解。然而，像生物矿化和珊瑚虫出芽这样的关键生长过程发生在骨架-管道网络（skeleton–canal network）内部。该网络由坚硬的骨架和内部充满共肉组织的管道组成。这些管道连接着珊瑚虫并促进各种生物学功能。因此，不可能通过现有的方法和技术获得详细的可视信息，这凸显了它们的局限性。珊瑚群体表面的骨架和共肉组织阻碍了对骨架构建、管道结构变化以及珊瑚虫出芽或运动等过程的体内观察，使得这些研究尤其具有挑战性。
微计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT）能够在单次采集中提供全面的结构信息，使其适用于研究隐藏在珊瑚群体内部与精细骨架和管道结构相关的动态生长过程。Micro-CT基于X射线成像原理，提供了一种非破坏性方法，可在单次采集中获得内部骨架-管道网络的全面结构信息。与依赖于劳动密集型且对结构有破坏性的样品制备的传统方法（如扫描电子显微镜SEM和切片磨削）相比，micro-CT消除了嵌入、抛光或包被等步骤的需要。在本研究中，活体群体和碎片被轻轻吸去多余海水并在空气中扫描，从而能够直接对完整的骨架-管道网络进行成像，同时保持样品在后续维护中的活力。这种能力促进了对珊瑚骨架微观结构的定量分析，并且在造礁珊瑚的研究中变得越来越重要。
根据世界海洋物种名录（The World Register of Marine Species, WoRMS）提供的信息，Montipora是石珊瑚中最大且最多样化的属之一，约有85个已知物种，使其成为仅次于Acropora的第二大物种丰富的珊瑚属，广泛分布于印度-太平洋珊瑚礁生态系统。其广泛存在和作为礁石建造者的角色使其成为研究珊瑚生长模式和生物矿化过程的理想模型。理解Montipora的群体生长模式、珊瑚虫出芽机制和生物矿化过程对于洞察珊瑚礁形成和恢复力至关重要。在这项工作中，我们选择该珊瑚属中的Montipora capricornis作为研究对象。在我们之前对该物种的研究中，我们发现M. capricornis属于复杂珊瑚支系，其特点是具有一个精致的管道系统，包含三种类型的管道：用于容纳珊瑚虫的珊瑚杯（calices）、连接相邻珊瑚杯的网状管道（mesh-like canals），以及珊瑚杯下方连接群体内所有珊瑚杯的管状管道（tubular canals）。网状和管状管道构成了一个集成的网络，促进了珊瑚群体内的基本生物过程。其结构复杂性和珊瑚虫之间的紧密连接使我们更容易通过重建骨架和管道来获取珊瑚生长信息。
使用高分辨率micro-CT对九个M. capricornis样品（四个群体，五个碎片）进行扫描，我们重建了活跃边缘处的三维骨架-管道网络和珊瑚虫-管道系统。我们还对珊瑚虫出芽和珊瑚杯构建等动态过程进行了可视化建模，以阐明所涉及的增长模式。这些模型使我们能够分析和总结骨架形成和珊瑚虫出芽的顺序。我们还研究了生长过程中骨架-管道网络的结构变化，为珊瑚生物矿化研究提供了理论基础。我们在M. capricornis的管道中识别了形态学出芽标记（morphological budding markers）。在本研究中，我们使用术语“形态学出芽标记”来指代一种反复出现的骨架结构，它指示了珊瑚虫在群体内出芽或易位的位置。基于这些标记，我们可以追踪珊瑚虫的运动和出芽模式，从而实现与珊瑚定向生长相关的生长轴的可视化。这一发现加深了我们对M. capricornis群体内珊瑚虫出芽和迁移动力学的理解，为生物矿化研究和环境响应建模提供了基础。
2 结果
2.1 M. capricornis的生长区和动态骨架形成
M. capricornis边缘的生长区可以明显分为三个区域。群体边缘的颜色变化主要是由于珊瑚杯或管道系统内是否存在珊瑚虫。最外层区域是白色半透明骨架（Zone A1），宽度约为1 mm。靠近群体中心的区域（Zone A3）由于管道系统内或表面上存在带有虫黄藻的珊瑚虫和共肉组织而呈现虫黄藻的颜色。在A1和A3之间，有一个约3 mm的颜色渐变区（Zone A2），其中半透明骨架内的管道系统包含正在运输过程中的新出芽珊瑚虫，其颜色与Zone A3相似但相对较浅。
我们使用高分辨率micro-CT重建了M. capricornis群体边缘的骨架结构和珊瑚虫-管道系统。三维重建揭示了网状管道和管状管道的存在，两者都对珊瑚生长不可或缺。网状管道连接相邻的珊瑚杯，而管状管道在珊瑚杯下方形成互连的网络。我们观察到在一些管状管道内存在较大的空隙（体积约1 mm3，骨架-空隙比20%–35%），位于相邻珊瑚杯之间，我们称之为转运区（transit areas, Ta）。这些结构可能作为新出芽珊瑚虫运动的通道，这是从其大小和在管道网络中的位置推断出来的。在存在新珊瑚杯的样品中，转运区似乎已融入管状管道，这表明在珊瑚虫建立后，该结构可能已被修改，尽管这是从观察到的骨架模式推断的。这使我们能够可视化它们的生长，揭示骨架形成模式，并模拟动态生长过程，包括珊瑚虫出芽和运动。
根据重建结果，我们可以将M. capricornis群体边缘区域的生长和出芽过程可视化。在最外层区域形成带有管道系统的骨架之后，新的珊瑚杯开始形成，而出芽珊瑚虫的基部开始构建用于运输的大管道。当转运区连接这些珊瑚杯的基部时，新出芽的珊瑚虫可以通过管道进入其新的珊瑚杯。我们的观察表明，骨架-管道网络是动态构建的，有证据表明珊瑚虫出芽和建立存在重复循环，这是从管道结构和珊瑚杯分布的模式推断出来的。在此过程中，Zone A1和A2继续扩张，启动新一轮生长，使这一循环在珊瑚群体内持续下去。
2.2 珊瑚虫-管道系统的三维可视化
我们重建了三维珊瑚虫-管道系统，以可视化珊瑚生长过程中的模式，如群体分支、骨架形成、管道延伸和珊瑚虫出芽。M. capricornis碎片中珊瑚虫-管道系统的重建揭示了珊瑚虫出芽和骨架形成模式的调控。三个顺序排列的珊瑚杯（依次指定为P1到P3）包含珊瑚虫。这三个珊瑚杯集中在近端侧，而群体边缘仅包含管状和网状管道。这表明，在珊瑚生长过程中，新骨架生长和管道系统形成的矿化作用先于珊瑚虫出芽和运动。珊瑚虫-管道系统重建的垂直截面S1到S3描绘了珊瑚杯P1到P2和P2到P3之间管状管道内的两个大空腔。这些转运区是管状管道内较大的空隙，为新出芽的珊瑚虫提供了通道。我们的观察表明，这些区域是珊瑚虫出芽的关键标记，并在群体内珊瑚虫的定向生长和迁移中起着至关重要的作用。虽然群体内珊瑚虫运动的确切机制仍不清楚，但我们的数据表明，新出芽的珊瑚虫在形成后被动地通过管道系统迁移。转运区促进了这种迁移，引导珊瑚虫到达它们新的珊瑚杯。珊瑚虫的运动似乎是由连接整个群体珊瑚虫的共肉组织向外延伸所驱动的。这些重建表明，这些管道作为新出芽珊瑚虫在具有出芽关系的相邻珊瑚杯之间移动的转运区。一个类似的管道位于靠近群体边缘的珊瑚杯P3的基部附近，推测一个新的珊瑚虫在出芽后会在那里出现。
基于重建结果，我们可以可视化M. capricornis群体在边缘区域的生长和出芽过程。在最外层区域形成带有管道系统的骨架之后，新的珊瑚杯开始形成，而出芽珊瑚虫的基部开始构建用于运输的大管道。当转运区连接这些珊瑚杯的基部时，新出芽的珊瑚虫可以通过管道进入其新的珊瑚杯。
2.3 转运区作为珊瑚生长分析中的形态学出芽标记
具有不同体积和结构的较大转运区存在于具有出芽关系的相邻珊瑚虫之间，这与管状管道不同。为了更好地表征转运区和管状管道之间的差异，我们使用VG Studio Max 3.3进行了体素体积测量。发现转运区的体积范围约为1 mm3，骨架-空隙比为20%–35%。相比之下，管状管道的单个体积较小，约为0.2 mm3，骨架-空隙比较高，为45%–55%。在体积和骨架-空隙比上的这种区别证实了转运区在结构上不同于标准的管状管道。这种差异至关重要，因为它表明转运区是专门为促进新出芽珊瑚虫的运动而适应的。
这些转运区可作为形态学出芽标记，用于研究M. capricornis的生长模式。它们被用于研究珊瑚生长模式，包括群体扩张方向、生长轴、珊瑚虫出芽轨迹和骨架形成速度。
我们重建了M. capricornis群体板块碎片内的所有珊瑚虫和出芽标记。在珊瑚虫-管道系统内，作为出芽标记的转运区形成了一个扇形的出芽轨迹网络，连接相关的珊瑚虫。这些轨迹沿着锯齿状线定向延伸，相邻出芽轨迹之间的间距在延伸过程中发生变化，表明骨架形成的速度不同。转运区也显示出不同的长度，导致珊瑚虫分布不均匀。
靠近扇形碎片外围的出芽轨迹较短，包含的珊瑚虫较少。从上到下第六和第七条出芽轨迹包含更多珊瑚虫，将其最外层的珊瑚虫定位在更靠近碎片生长点的位置。因此，这两条出芽轨迹倾向于接近该碎片的生长轴。这种方法还使我们能够可视化整个珊瑚群体的生长轴。
3 讨论
3.1 珊瑚生长过程中骨架先于珊瑚虫形成
我们对M. capricornis骨架-管道网络的三维重建不仅描述了一种新的形态学出芽标记，而且揭示了一种特定的生长策略，其中骨架形成、管道重塑和珊瑚虫出芽在空间和时间上紧密耦合。
重建表明，M. capricornis的生长始于外围骨架-管道的形成，随后是共肉延伸和珊瑚虫出芽。在最靠近外缘的珊瑚杯侧面，观察到一个相对较大的转运区，这可能有助于新出芽珊瑚虫在新珊瑚杯中的建立，这是从它们与管道网络的空间排列推断出来的。这个大体積的转运区可以被认为是M. capricornis的形态学出芽标记。同时，在共肉组织延伸的区域，新的珊瑚杯被构建。一旦新的珊瑚杯完成，转运区连接出芽位点和新的珊瑚杯，使珊瑚虫能够进入其新的珊瑚杯。
根据推断的新珊瑚虫建立后，转运区可能融入管状管道，这表明存在结构同化，这值得进一步研究。在这个生长过程中，初始阶段涉及在外围形成具有复杂管道结构的骨架框架，随后是共肉组织通过内部管道网络向外延伸。这种循环生长过程可能涉及共肉组织构建骨架-管道网络，然后是珊瑚虫出芽，转运区可能促进珊瑚虫沿着特定管道建立，这是从观察到的结构推断出来的。在珊瑚杯之间建立大体積转运区是促进新珊瑚虫出芽和定殖的重要机制。这种空间安排确保了珊瑚群体内新出芽珊瑚虫的有效运输。我们关于骨架-管道网络和转运区的发现提供了一个结构框架，可以与未来的分子和遗传学研究相关联，以理解珊瑚中生物矿化和出芽过程的调控，可能为蛋白质表达和信号通路分析提供信息。这些见解揭示了珊瑚生长背后复杂的生物学过程。
重要的是要注意，micro-CT成像主要解析矿物骨架和内部管道空间，而软组织本身仍然低于我们扫描的分辨率。因此，出芽期间共肉及相关器官的位置和变形是从观察到的骨架和管道结构推断出来的，而不是直接成像的。未来的工作将micro-CT与补充技术（如连续组织学、体内荧光成像或对比增强三维断层扫描）相结合，对于在出芽期间生成共肉的明确解剖学重建至关重要。这种集成方法将允许实现此处设想的详细解剖学插图，并提供组织动力学和骨架形成之间耦合的更完整图像。
3.2 珊瑚生长过程中骨架形成与溶解共存
珊瑚生长过程的可视化揭示，在骨架-管道系统的形成过程中，不仅会出现新的骨架，而且由于出芽、珊瑚虫易位、珊瑚杯构建等需求，原有骨架的结构也会发生改变和溶解。例如，当用于珊瑚虫出芽和运动的转运区开始在管状管道中出现时，珊瑚杯和管状管道的形成始于群体的最外缘，那里最初仅包含骨架内的网状管道，随着新珊瑚杯的体积逐渐增加到与其他现有珊瑚杯相匹配，在预先存在的骨架框架中存在着减小或结构改变的过程，这可能同时对细胞外钙化介质（extracellular calcifying medium, ECM）产生影响。研究人员假设属于基质金属蛋白酶基因家族的基质金属蛋白酶24（matrix metalloproteinase 24）可能在珊瑚钙化和骨架形成中发挥作用，并具有平衡和调节ECM蛋白质降解的功能，或与此过程相关。这表明利用micro-CT技术重建骨架-管道网络可以为研究珊瑚生长和骨架形成提供动态视觉证据，并可能促进分子水平上的珊瑚生物矿化研究。
3.3 M. capricornis中出芽标记的识别及其意义
我们在M. capricornis的珊瑚虫-管道系统中识别了形态学出芽标记。具体来说，在生长过程中，出芽珊瑚虫所在的珊瑚杯侧面会形成一个较大的管道区域。该区域逐渐延伸到新形成的珊瑚杯并与之连接，促进新出芽珊瑚虫的运输。运输后，该区域融入管状管道，具有独特的结构特征，即尺寸较大和骨架-空隙体积比较小。基于这些出芽标记，我们可以通过micro-CT和三维重建确定M. capricornis群体内珊瑚虫之间的出芽关系，从而使我们能够可视化生长轴、珊瑚虫运动轨迹、骨架-管道网络的形成过程等。
与Pocillopora和Stylophora竹节状的珊瑚杯（其珊瑚虫运动轨迹很容易从骨架和管道结构中辨别）相比，M. capricornis错综复杂的管道网络对可视化提出了更大的挑战。与我们2021年研究中提出的方法（涉及从近端分叉点到远端边缘重建群体每个分支中的管道）相比，基于出芽标记的管道重建可以更精确地可视化M. capricornis的生长轴。因此，追踪M. capricornis中的珊瑚虫生长和出芽轨迹代表了在理解珊瑚生长动力学和骨架形成过程方面的进步，突出了对这个复杂属的研究的突破性价值。
在生态学上，标记可以量化珊瑚虫分布以用于移植指标和模拟环境影响（例如，温度对生长轴的影响），为季节性恢复力模式提供信息，并增强气候变化下的模块化生长模拟。我们基于形态学出芽标记的重建结果作为研究外部因素对珊瑚生长影响的视觉证据。结合不同阶段的水流、温度变化和光照暴露信息，这将使我们能够分析在不同外部环境因素下珊瑚虫-管道系统构建的速度和模式差异。因此，我们可以深入了解在不同外部条件下影响珊瑚生长的年度、季节和月度机制。该方法还可用于快速估算珊瑚群体内单位体积的珊瑚虫分布，为珊瑚移植提供定量指标。总之，沿生长轴重建出芽标记和珊瑚虫-管道系统使我们能够揭示造礁珊瑚的循环生长模式。转运区作为出芽标记的识别和珊瑚虫-管道轨迹的重建为理解群体规模的生长方向性如何从骨架形成、管道重塑和珊瑚虫出芽之间的局部相互作用中涌现提供了结构框架。这些见解与造礁珊瑚中礁体扩张和空间占据的模型直接相关。此外，识别出的出芽标记，特别是转运区，可以纳入现有的珊瑚生长模型，例如那些基于珊瑚虫复制的模型。例如，转运区的空间分布和频率可用于参数化群体扩张模型，从而深入了解不同环境条件下的模块化生长动力学。
4 方法
4.1 样品收集
M. capricornis样品于2018年从西沙群岛（15°40′–17°10′ N, 111°-113° E）收集。样品采集自热带浅水礁，深度范围5至10米，日平均温度23.2°C至29.2°C。采集点海水pH值为8.1–8.2，盐度为34 ppt。收集了四个完整群体和五个板块碎片，来自不同个体以确保遗传多样性。碎片来自不同的群体以避免冗余，并通过视觉确认其形态相似性。采样间隔约为20米。
4.2 物种选择与鉴定
我们选择Montipora capricornis进行本研究是因为其作为印度-太平洋地区造礁者的生态重要性以及缺乏关于其生长和出芽机制的详细研究。该物种的鉴定基于WoRMS描述的形态特征，并通过基于我们先前上传至国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）的M. capricornis基因组数据（GCF_036669925.1）的遗传分析得到确认。鉴定基于关键特征，如群体生长形式、珊瑚虫大小和骨架结构，使用传统分类学方法和现代遗传技术进行验证。
4.3 Micro-CT测试
使用新一代230 kV X射线微焦点计算机断层扫描系统（Phoenix v|tome|x m; General Electric, GE; 位于上海英华无损检测）构建的3D模型分析珊瑚样品。在我们的实验中，扫描前，将群体和碎片从水族箱中短暂取出，吸干多余水分，并在空气中安装在micro-CT平台上，无需任何额外的固定、脱水或包埋。扫描参数详见表1，减小样品体积可提高分辨率。使用GE的专有软件从扫描切片矩阵组装每个标本的二维图像重建。使用VG Studio Max 3.3进行三维重建，并对骨架-管道网络进行可视化和分析，以基于在群体不同部位观察到的结构变化推断生长模式。鉴于每个样品单次扫描，动态生长过程是通过比较不同生长阶段多个样品的结构变化推断出来的，详见后续动态过程模拟部分。Micro-CT实验无需样品制备，能够直接检查活体标本，并确保所有样品在整个成像过程中保持活力。这种非破坏性方法为研究珊瑚生长过程和模式提供了独特优势，在分析过程中保留了样品的自然状态。
4.4 骨架、珊瑚虫和管道的三维重建
然后使用三维重建软件分析和处理源自扫描的切片数据。使用VG Studio Max（v3.3.0）进行骨架-管道网络和珊瑚虫-管道系统的重建。三维重建是按照先前描述的方法创建的。重建图像从Mimics和VG Studio Max导出，并在Adobe Photoshop CC 2019和Adobe Illustrator CC 2019中完成最终处理。图中的垂直截面S1-S3是通过在VG Studio Max中定义垂直于群体表面并平行于局部生长轴的平面作为虚拟切片获得的。这些平面的位置被设定为与感兴趣的珊瑚杯和相应转运区的中心相交。
4.5 动态珊瑚生长过程模拟
通过结构进展（例如，转运区出现）对静态重建（碎片中40-60个珊瑚虫，群体中数千个）进行排序以模拟时间性，并在先前研究中得到验证。在五个碎片中确认了可重复性，未来有时间序列确认的潜力（6-12个月）。
4.6 骨架-空隙比测量
珊瑚样品的骨架物质与空隙体积比（称为“骨架-空隙比”）在VG Studio Max 3.3中使用表面确定、手动区域选择和孔隙度分析进行计算。转运区（约1 mm3，20%–35%比率±5%标准差）与管状管道（约0.2 mm3，45%–55% ±7%标准差；n=5）不同。详细数据见表2。误差传播考虑了体素变异性。
