《Synthetic and Systems Biotechnology》：Regulating protein glycosylation modification enhances the synthesis of taxadiene in
Saccharomyces cerevisiae
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本研究针对紫杉醇关键前体紫杉二烯在真核系统中产量受限的难题，通过敲除酿酒酵母内源糖基转移酶基因mnn11调控蛋白糖基化修饰，使紫杉二烯合成酶(TS)表达量提升126%，摇瓶产量提高65.2%。结合多拷贝整合TS基因与强化GGPP合成模块，最终在5-L生物反应器中实现1.26 g/L的紫杉二烯产量，为微生物合成紫杉醇提供了关键技术支持。
紫杉醇作为高效广谱的抗癌药物，其传统获取方式严重依赖珍稀红豆杉植物资源。每生产1公斤紫杉醇需砍伐2000-2500棵红豆杉树，导致这一珍贵物种濒临灭绝。虽然化学半合成法提高了资源利用率，但未能从根本上解决资源短缺问题。合成生物学技术的出现为突破植物天然产物获取瓶颈带来了新希望，其中紫杉二烯作为紫杉醇生物合成途径中的关键前体，其高效微生物合成成为制约下游产物生产的关键环节。
在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表的最新研究中，天津大学元英进教授团队创新性地通过调控酿酒酵母的蛋白糖基化修饰系统，显著提升了紫杉二烯的合成效率。该研究发现在真核表达系统中，异源蛋白常因过度糖基化修饰而导致表达水平和功能活性受限，特别是紫杉醇合成途径中涉及的多个P450酶和萜类合酶，其异源表达常受宿主蛋白表达系统和翻译后修饰机制的限制。
研究人员首先构建了能够合成紫杉二烯的工程菌株，随后系统评估了四种糖基转移酶(alg3、alg6、mnn11和och1)基因敲除对紫杉二烯合成的影响。令人惊喜的是，mnn11糖基转移酶基因的缺失使紫杉二烯产量提升至32.7 mg/L，较对照菌株提高65.2%。进一步的N-糖基化蛋白质组学分析揭示了mnn11敲除菌株中14个上调和21个下调的糖基化蛋白，其中蛋白二硫键异构酶(PDI)和甲酸脱氢酶1等蛋白折叠和能量代谢相关蛋白的上调，显著促进了紫杉二烯合成途径的高效运行。
为验证这一发现，研究团队通过Western blot分析证实mnn11敲除菌株中完整紫杉二烯合成酶(TS)蛋白表达量增加了126%。这一结果从分子水平解释了糖基化修饰调控如何增强异源蛋白表达的内在机制。在此基础上，研究人员进一步采用多拷贝整合策略，将TS基因与G418抗性基因共表达模块整合到酵母基因组的Ty2多位点，通过G418浓度梯度筛选获得含有9个TS基因拷贝的高产菌株，使紫杉二烯产量达到113.5 mg/L。
研究团队还通过强化前体供应途径进一步提升产量。他们在酵母基因组的HO、TKL2和YL1062W位点依次整合GGPP合成模块(包含tHMG1和BST1-ERG20融合蛋白)，使紫杉二烯产量提高2.69倍，达到420.4 mg/L。最终，在5-L生物反应器中通过两阶段发酵策略(生长期30°C，生产期20°C)，采用葡萄糖-乙醇碳源切换和二十烷两相萃取技术，实现了1.26 g/L的紫杉二烯产量，创下异源合成最高纪录。
本研究采用的关键技术方法包括：基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术构建糖基转移酶敲除菌株；N-糖基化蛋白质组学分析差异表达蛋白；Western blot检测目标蛋白表达水平；G418抗性筛选系统实现多拷贝基因整合；实时荧光定量PCR确定基因拷贝数；5-L生物反应器两级发酵工艺优化。所有实验菌株均以CEN.PK2-1C为背景菌株。
研究结果部分显示，通过系统调控糖基化修饰、强化关键酶表达和优化前体供应，成功建立了高效的紫杉二烯生物合成平台。具体而言：
3.1节研究表明mnn11基因敲除显著提升TS表达和紫杉二烯产量；
3.2节通过蛋白质组学揭示糖基化调控促进蛋白折叠和细胞代谢的分子机制；
3.3节证实多拷贝整合使TS蛋白表达量提升485%；
3.4节显示GGPP合成模块强化使产量提高2.69倍；
3.5节通过发酵工艺优化最终实现1.26 g/L的产量。
该研究的创新之处在于首次系统阐明了糖基化修饰调控对紫杉二烯合成的促进作用，建立了从基因编辑、代谢工程到发酵工艺的完整技术体系。这不仅为紫杉醇的微生物合成提供了充足的原料供应，更开创了通过改善异源蛋白与微生物底盘兼容性来提高天然产物合成效率的新策略。这一研究成果对保护珍稀植物资源、实现紫杉醇的可持续生产具有重要战略意义，也为其他高价值萜类化合物的微生物合成提供了可借鉴的技术范式。
