《Scientific Reports》：A stability-indicating RP-HPLC method for the simultaneous quantification of brimonidine tartrate and timolol maleate in bulk drug substances and pharmaceutical dosage forms
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本研究针对固定复方制剂Combigan?（含溴莫尼定酒石酸盐BT与噻吗洛尔马来酸盐TM）的质量控制需求，开发并验证了一种稳定性指示RP-HPLC方法。该方法采用C18色谱柱与pH 7.0缓冲液-乙腈（80:20）流动相，可在10分钟内实现BT与TM的基线分离，并有效区分其降解产物。方法验证显示线性范围广（BT: 0.24-500 ppm；TM: 0.60-1250 ppm）、精密度高（RSD<2%）、回收率良好（98.71%-101.10%）。强制降解实验证实TM在强酸、碱及氧化条件下更易降解。该方法符合ICH指南，为复方青光眼制剂的质量控制与稳定性研究提供了可靠工具。
青光眼是全球范围内导致不可逆性盲的主要眼病之一，其关键可干预风险因素是眼内压（IOP）的升高。临床治疗中，当单药治疗效果不佳时，固定复方制剂因其能提高患者依从性而备受青睐。Combigan?正是一种这样的复方滴眼液，它同时含有0.2%的溴莫尼定酒石酸盐（Brimonidine Tartrate, BT，一种选择性α2肾上腺素能受体激动剂）和0.5%的噻吗洛尔马来酸盐（Timolol Maleate, TM，一种非选择性β-肾上腺素能阻滞剂）。这两种成分通过不同机制协同降低眼压，但其在制剂中的稳定性以及在生产、储存过程中可能产生的降解产物，会直接影响药品的安全性与有效性。因此，开发一种能够同时准确测定这两种活性成分，并能有效区分其与降解产物的分析方法，对于保障Combigan?的质量至关重要。然而，已有的分析方法或存在线性范围窄、或缺乏稳定性指示能力、或分离效果不理想等局限性。为此，研究人员在《Scientific Reports》上报道了一项研究，旨在开发并全面验证一种专属性强、准确、精密且快速的稳定性指示反相高效液相色谱法（RP-HPLC），用于Combigan?中BT和TM的同步定量分析。
本研究采用的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是核心关键技术。方法开发阶段系统优化了色谱柱、流动相pH值、有机相比例等关键参数。方法学验证严格遵循ICH Q2(R1)等指南，系统评估了方法的专属性、线性范围、准确度、精密度（包括重复性、进样精密度和中间精密度）、耐用性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。此外，研究还进行了强制降解实验，通过酸、碱、氧化、热、光等应激条件考察方法的稳定性指示能力，并利用绿色分析化学（GAC）指标（如分析生态尺度、GAPI和AGREE）评估了方法的环境友好性。研究所用Combigan?样品为市售品。
方法开发与优化
研究人员首先致力于建立最佳的色谱分离条件。通过考察不同C18色谱柱的性能，最终选定Supelco Discovery C18柱（25 cm x 4.6 mm, 5μm）作为固定相。优化后的流动相为pH 7.0的30 mM三乙胺磷酸盐缓冲液与乙腈（80:20, v/v），采用等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长根据两种药物的最大吸收分别设定为245 nm（BT）和295 nm（TM）。在此条件下，BT和TM能实现良好分离，保留时间分别约为4.3分钟和5.2分钟，且峰形对称，理论塔板数高。
系统适用性
在进行分析前，对色谱系统进行了适用性验证。通过连续进样标准品溶液，计算关键参数。结果显示，BT和TM的保留时间和峰面积的相对标准偏差（%RSD）均低于1%，拖尾因子在0.9-2.0之间，理论塔板数远高于2000的要求。这表明整个色谱系统性能稳定，能够满足后续定量分析的要求。
专属性与强制降解研究
专属性是稳定性指示方法的核心。研究人员通过强制降解实验来验证该方法能否将BT和TM与其降解产物有效分离。将药物样品置于酸（HCl）、碱（NaOH）、氧化（H2O2）、热和光照等应激条件下。结果表明，BT表现出极高的稳定性，尤其在热和光条件下24小时内几乎无降解，在酸、碱、氧化条件下降解率也极低（均低于1.5%）。相比之下，TM对酸、碱和氧化条件更为敏感，在3 M HCl、1 M NaOH和3% H2O2作用下，降解率分别达到22.5%、24.7%和58.5%。重要的是，在所有降解实验中，主药峰均能与降解产物峰实现完全分离，证明该方法具有良好的专属性。
线性与范围
该方法在较宽的浓度范围内表现出优异的线性关系。BT在0.24至500 ppm范围内，TM在0.60至1250 ppm范围内，其峰面积与浓度均呈良好线性，相关系数（R2）分别达到0.9992和0.9996，满足定量分析的要求。
准确度与精密度
准确度通过加样回收率实验评估。在80%、100%、120%三个浓度水平下，BT的平均回收率在99.42%至99.82%之间，TM的平均回收率在98.71%至101.10%之间，均符合95%-105%的可接受标准。精密度评估包括重复性（同一天同一操作者）、进样精密度（同一样品连续进样）和中间精密度（不同天、不同分析员、不同仪器）。所有层面的精密度考察中，BT和TM峰面积的%RSD均低于2%，显示了方法的高度重现性。
检测限与定量限
该方法展现出高灵敏度。基于信噪比（S/N）法，BT的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别确定为0.08 ppm和0.24 ppm；TM的LOD和LOQ分别为0.20 ppm和0.60 ppm。在LOQ浓度下进行重复性实验，%RSD小于5%，证实了方法在低浓度下的可靠定量能力。
耐用性
通过有意改变流动相pH（±0.2）、有机相比例（±2%）、流速（±0.2 mL/min）、检测波长（±2 nm）和进样体积（±2 μL）等关键参数，考察方法的耐用性。结果表明，这些微小变动对色谱分离效果（如保留时间、理论塔板数、拖尾因子）均无显著影响，方法表现出良好的稳健性，能够适应日常实验室分析中的正常波动。
溶液稳定性
考察了样品溶液在室温下的稳定性。在72小时内，BT和TM的峰面积变化均很小（%变化小于0.5%），且未出现新的降解峰，表明样品溶液在分析期间稳定性良好。
绿色度评估
研究还从绿色分析化学（GAC）角度评估了该方法的环境友好性。通过分析生态尺度（得分约75，属可接受的绿色方法）、GAPI和AGREE（得分0.57/1.0）三种工具评估，表明该方法具有分析时间短、能耗低等优点，但乙腈的使用和废液直接处理是其主要环境负担，为未来进一步绿色化改进指明了方向。
本研究成功开发并验证了一种用于同时测定Combigan?中溴莫尼定酒石酸盐和噻吗洛尔马来酸盐的稳定性指示RP-HPLC方法。该方法成功解决了以往方法的局限性，具有线性范围宽、灵敏度高、精密度和准确度好、专属性强等优点。强制降解研究不仅证明了方法的稳定性指示能力，还揭示了噻吗洛尔马来酸盐在强酸、强碱和氧化条件下相对不稳定的特性，这为制剂的生产、包装和储存条件提供了重要的科学依据。全面的方法学验证表明该方法完全符合ICH、USP和FDA的指导原则。此外，对方法绿色度的评估体现了研究者对可持续分析的关注。该方法的建立为Combigan?及其类似复方制剂的质量控制、稳定性考察和常规释放检验提供了一个可靠、高效且符合法规要求的分析工具，有助于确保青光眼治疗药物的质量、安全性和有效性。
