糖蛋白A跨膜螺旋突变膜插入与二聚化自由能模拟研究

《Biophysical Journal》：Membrane insertion and dimerisation of glycophorin-A mutations studied by free energy simulations

本研究通过自由能微扰(FEP)模拟，系统分析了糖蛋白A(GpA)跨膜区30余种点突变对膜插入和二聚化自由能的影响。研究在POPC、POPE等多种脂质环境中验证了GxxxG基序突变对螺旋相互作用的调控机制，首次量化了氢键(~-1.0 kcal/mol)和甲基基团(~0.5 kcal/mol)对二聚稳定的贡献，为膜蛋白理性设计提供了理论依据。

　　

在细胞的生命活动中，膜蛋白犹如精密运作的分子机器，其功能往往依赖于多个跨膜螺旋的精准组装。然而，这些螺旋如何在疏水且动态的脂质双分子层中识别彼此并形成稳定复合物，一直是生物物理领域的未解之谜。糖蛋白A(GpA)因其简单的单次跨膜结构和明确的GxxxG二聚化基序，成为研究这一过程的经典模型。尽管已有大量实验研究，但由于实验条件的多样性、膜模拟体系的局限性以及难以在分子层面量化能量贡献，人们对跨膜螺旋二聚化的驱动力和特异性仍缺乏统一认识。

为了解决这些问题，来自德国慕尼黑工业大学的Cong Van Quy、Martin Kulke和Martin Zacharias团队在《Biophysical Journal》上发表了最新研究。他们采用原子尺度的自由能模拟方法，系统探究了GpA跨膜区点突变对膜插入和二聚化过程的影响，并深入分析了不同脂质环境对这些过程的调控作用。

研究主要运用了以下关键技术方法：基于热力学循环的双拓扑自由能微扰(FEP)计算，在NAMD 3.0b6软件中采用CHARMM36m力场和TIP3P水模型，对嵌入POPC、POPE等均质脂质双层的GpA体系进行模拟；通过多态Bennett接受比(MBAR)方法估计相对自由能变化；利用埋藏表面积(BSA)和螺旋交叉角等结构参数分析二聚体构象变化。

3.1 第一阶段：α螺旋突变从水到膜相对分配概率的变化

研究人员首先评估了单点突变对GpA单体从水相转移到不同脂质膜(包括POPC、POPE、PLPC和PYPC)的自由能影响(ΔΔG_tran^mono)。模拟结果显示，非极性到非极性突变的转移自由能与实验测得的MF疏水性标度及dsTβL插入实验数据高度吻合。值得注意的是，位于膜中心的突变其转移自由能受脂质类型影响较小，而位于水-膜界面附近的突变(如L75、I76、T87)则表现出明显的脂质依赖性，差异可达~1 kcal/mol。这反映了脂质头基性质对界面处残基能量学的调制作用。研究还发现，对于极性突变，模拟结果略微高估了其 destabilization 效应，这可能是因为生物膜中存在转位子辅助等机制，而模拟采用的两阶段模型未包含这些因素。

3.2 第二阶段：突变对均质膜中GpA二聚化稳定性的影响

通过模拟GpA二聚体在脂质双层中的突变，研究获得了相对二聚化自由能变化(ΔΔG_mut)。在排除六个异常突变点后，模拟数据与TOXCAT实验测得的表观自由能变化(ΔΔG_mut^TOXCAT)在POPC和POPE膜中均显示出显著相关性(皮尔逊相关系数R分别达0.886和0.790)。对于GxxxG基序中的甘氨酸突变为体积较大残基的情况，二聚体结构会发生显著扰动，甚至解离。为此，研究者在部分突变模拟中对末端Cα原子施加了弱位置约束，以维持近天然二聚体构象并确保自由能收敛。结果表明，脂质环境对二聚化自由能变化的影响总体较小，但对于影响中央GXXXG相互作用基序的甘氨酸突变则较为显著。

3.3 氢键和甲基基团对二聚稳定的能量贡献

研究特别关注了界面残基V84和T87的突变。V84S突变能形成稳定、对称的跨螺旋氢键(S84与T87之间)，使二聚体稳定约-4 kcal/mol。相比之下，V84T突变由于空间位阻无法形成最优氢键几何结构，因而没有类似的稳定效果。通过比较V84S和V84A(约-2 kcal/mol)的稳定化能量差，研究者估算单个跨螺旋氢键的贡献约为-1.0 kcal/mol。在甲基基团贡献方面，L75V和V80A突变分别导致约1.3 kcal/mol和0.64 kcal/mol的去稳定化，而I76V和T87S则表现出轻微的稳定化或去稳定化效应，表明单个甲基基团的贡献约为0.5 kcal/mol，且其效果取决于突变位置和脂质环境。

3.4 GxxxG突变对跨膜二聚体稳定性的环境依赖性效应

GxxxG基序的序列特异性一直是争论的焦点。模拟发现，将甘氨酸突变为侧链较大的残基会显著破坏二聚体稳定性(2.5-4 kcal/mol)，但丙氨酸突变(G79A, G83A)仍能保留部分稳定性(ΔΔG_mut< 2.5 kcal/mol)。值得注意的是，G79A和G83A在结构响应上存在差异：G83A突变体与脂质头基形成更多氢键，导致倾斜角灵活性增加，其自由能计算无需位置约束即可收敛。而在不饱和脂质PLPC和PYPC膜中，G83A、G83I和G83T突变体表现出明显的稳定化效应，表明增强的脂质动力学可以补偿由大残基引入的堆积和熵扰动。这揭示了膜介导的熵在二聚体稳定中的作用。

本研究成功建立了一个计算框架，利用原子尺度的化学自由能模拟来评估GpA二聚体的热力学稳定性。该方法的准确性通过MBAR方法得到增强，结果与实验数据高度吻合。研究表明，范德华相互作用是二聚体结合的主要驱动力，氢键仅在有利的堆积约束下贡献约-1.0 kcal/mol的能量。同时，脂质流动性对二聚化具有间接稳定作用，特别是在G79A和G83A等突变体中，高流动性的脂质(如PLPC, PYPC)可通过补偿熵罚贡献高达~3 kcal/mol的稳定化能。这项工作不仅深化了对跨膜螺旋识别和组装分子机制的理解，证明了化学自由能模拟在量化膜蛋白相互作用方面的实用性，也为未来研究更复杂的膜蛋白体系以及设计新的膜蛋白相互作用奠定了基础。例如，该方法未来可用于探究胆固醇等脂质如何调节GpA二聚化等具体问题。