《Biology of Reproduction》：Single-cell metabolic profiling of stallion spermatozoa by flow cytometry using NADH and FAD autofluorescence
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本研究针对种马精子代谢异质性评估技术复杂、成本高昂的难题，开发了一种基于NADH和FAD自发荧光的流式细胞术无标记代谢检测方案。研究人员通过分析精子在不同能量底物（葡萄糖、乳酸、丙酮酸）刺激下的氧化还原状态变化（NAD(P)H/FAD比值与ORR），结合运动动力学参数与线粒体活性指数，揭示了精子对葡萄糖和乳酸的优先代谢特性及代谢区室化协作机制。该技术为临床精子功能评估提供了高效的单细胞分析工具，对优化精子保存液与体外受精培养基设计具有重要意义。
在哺乳动物生殖生物学中，精液长期被视为均质实体，但越来越多的证据表明其实际由功能各异的精子亚群构成。仅有少数精子能完成获能过程，而最终完成受精的只有一个精子。这种复杂性凸显了单细胞水平研究精液的重要性。与此同时，精子代谢作为维持精子功能与获能过程能量需求的核心环节，其研究却受限于传统代谢分析技术（如UHPLC/MS/MS或NMR）的高成本、低通量以及无法实现单细胞分辨率等问题。尤其对于种马精子而言，其对不同代谢物的响应机制尚不明确，亟需开发高效精准的分析方法以提升现有精子生物技术。
针对这一挑战，西班牙埃斯特雷马杜大学大学的研究团队在《Biology of Reproduction》上发表论文，创新性地利用流式细胞术检测精子内源性辅酶NAD(P)H和FAD的自发荧光，建立了无需标记的单细胞代谢表型分析方案。通过监测不同能量底物（葡萄糖、乳酸、丙酮酸及其组合）刺激下精子的氧化还原状态变化（NAD(P)H/FAD比值与光学氧化还原比率ORR），并结合计算机辅助精子分析（CASA）与线粒体膜电位检测，系统揭示了种马精子的代谢偏好及其与运动功能的密切关联。
关键技术方法主要包括：1）利用流式细胞仪（Cytoflex? LX）的紫外（355 nm）和紫光（405 nm）激光分别激发NAD(P)H和FAD自发荧光，通过特定滤片检测荧光强度；2）采用计算机辅助精子分析系统（ISAS Proiser）评估精子运动参数与动力学效率（KE）；3）使用荧光染料TMRM和ViaKrome 808分别检测线粒体膜电位与精子存活率；4）基于resazurin还原实验开发流式细胞代谢氧化 assay，评估精子对不同底物的代谢能力；5）应用FlowSOM算法对高维流式数据进行无监督聚类分析，识别代谢异质性亚群。
效果评估不同单一能量源对精子NADH、FAD及氧化还原参数的影响
研究发现，在PBS基础培养基中补充葡萄糖、丙酮酸或乳酸均可显著提升精子NAD(P)H荧光强度（P<0.0001），而非代谢性葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）无此效果。乳酸和丙酮酸处理还显著降低FAD荧光，导致NAD(P)H/FAD比值升高与ORR下降，表明精子整体向还原状态偏移。这一结果提示乳酸和丙酮酸主要通过线粒体代谢途径促进还原当量生成。
能量源组合对精子运动功能、线粒体活性及存活率的作用
在Tyrode's培养基中，能量源类型虽未影响精子总活力和直线运动率，但显著改变运动速度与动力学效率（KE）。乳酸单独或与葡萄糖/丙酮酸组合可显著提升KE值与线粒体活性指数（MAI）（P<0.01）。值得注意的是，精子在无外源能量时仍能维持运动，说明其具备内源性能量储备（如甘油三酯水解）。
精子亚群对能量源的异质性响应
通过FlowSOM聚类分析发现，精子群体对能量源的响应存在异质性：乳酸引起整体向还原状态转变，而丙酮酸仅使部分精子亚群发生响应，另一亚群保持氧化状态。葡萄糖与丙酮酸或乳酸组合则推动全体精子向高NADH/FAD比值的还原状态迁移，凸显代谢调控的细胞间差异。
氧化还原参数与精子功能的相关性分析
NAD(P)H/FAD比值与KE（r=0.7）和MAI（r=0.6）呈显著正相关（P<0.00001），而ORR与两者均呈负相关（r=-0.7至-0.6）。这表明精子的氧化还原状态可直接反映其运动效能与线粒体功能。
线粒体解偶联与电子传递链抑制验证代谢检测可靠性
使用FCCP解偶联线粒体后，NADH荧光显著降低（P=0.0004），而复合体I抑制剂鱼藤酮（Rotenone）则引起NADH积累（P=0.0241），证实该方法可灵敏捕捉代谢通路扰动引起的氧化还原变化。
精子底物代谢偏好性鉴定
基于resazurin还原的代谢 assay显示，种马精子在30分钟内即可高效氧化葡萄糖（P<0.01）、乳酸（P<0.05）和α-酮戊二酸（P<0.05），60分钟后氧化能力进一步增强。丙酮酸仅在长时间孵育后被动代谢，而乳糖未被利用。这一结果明确了精子对糖酵解和三羧酸循环中间体的优先利用策略。
本研究通过无标记流式细胞术成功绘制了种马精子的单细胞代谢图谱，揭示其代谢活动存在明显的区室化协作：葡萄糖主要在鞭毛糖酵解途径中被利用，并通过LDH-C介导的丙酮酸还原再生NAD+；而乳酸则通过线粒体LDH-B氧化为丙酮酸，进入三羧酸循环驱动氧化磷酸化。这种“乳酸穿梭”机制与精子运动效能和线粒体功能紧密偶联。所开发的代谢检测方案不仅为临床精子质量评估提供了低成本、高通量的工具，还为优化精子保存液与辅助生殖技术培养基提供了理论依据，有望推动种马繁殖效率的精准提升。
