《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Nanosized diesel exhaust particles induce mesenchymal stem cell senescence and alter small extracellular vesicle microRNA profiles: Implications for their functional properties
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本研究针对交通源超细颗粒物(nDEPs)经胎盘暴露影响胎儿健康的机制难题，以脐带间充质干细胞(UC-MSCs)为模型，系统揭示了nDEPs通过诱导氧化DNA损伤(8-OHdG)和细胞衰老，重塑小细胞外囊泡(sEVs) miRNA谱（如hsa-miR-6126、hsa-miR-424-5p等），进而通过MYC/SIRT1信号轴调控受体细胞周期和基因组稳定性的新机制，为环境污染物致发育毒性提供了重要实验证据。
随着城市化进程加速，交通源空气污染对母婴健康的威胁日益引发关注。尤其令人担忧的是，研究显示汽车尾气中的超细颗粒物（Ultrafine Particles, UFPs）能够穿越胎盘屏障，直接进入胎儿循环系统。这些纳米尺度的柴油机尾气颗粒（Nanosized Diesel Exhaust Particles, nDEPs）作为环境污染物，其粒径小于100纳米，比表面积大，易于携带多环芳烃（PAHs）和重金属等有毒物质深入生物体。流行病学调查已将孕期交通污染暴露与早产、低出生体重、神经发育异常等不良妊娠结局相关联，然而，这些颗粒物如何干扰胎儿发育的细胞分子机制，特别是对维持组织修复和再生的关键细胞—— prenatal stem cells（产前干细胞）的功能影响，仍是未解之谜。
传统毒理学研究多关注污染物对单一细胞的直接损伤，却忽略了细胞间通讯在毒性传播中的重要作用。近年来，小细胞外囊泡（small Extracellular Vesicles, sEVs）作为细胞间信息传递的重要载体备受关注。这些纳米级囊泡能够携带蛋白质、核酸等生物活性分子，在细胞间穿梭，调控受体细胞的基因表达和功能状态。环境应激是否通过改变sEVs的“货物”组成，从而放大毒性效应，成为环境健康领域的前沿科学问题。
在此背景下，泰国朱拉蓬研究所环境毒理学实验室的Mayer Calma等研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了最新研究成果。他们以人脐带来源的间充质干细胞（Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells, UC-MSCs）作为研究产前干细胞的替代模型，深入探究了nDEPs暴露对UC-MSCs的直接毒性效应，以及由sEVs介导的间接毒性效应。研究旨在回答几个核心问题：nDEPs是否会诱导UC-MSCs发生衰老？其sEVs的miRNA谱会发生怎样的改变？这些改变的sEVs对健康的受体细胞又会产生何种功能影响？其背后的关键信号通路是什么？
为解答这些问题，研究团队运用了多种关键技术方法。他们使用标准参考物质DEP SRM 1650b模拟环境中的nDEPs，对UC-MSCs进行短期（48小时）和长期（14天）暴露。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、纳米流式细胞术（nFCM）和Western blot等手段严格表征了sEVs的物理特性和分子标志物。采用小RNA测序技术全面分析了sEVs中miRNA的表达谱，并通过droplet digital PCR（ddPCR）进行验证。在功能研究方面，他们通过sEVs共培养实验观察其对受体细胞基因表达、细胞周期和凋亡的影响，并利用siRNA基因敲降技术验证了MYC和SIRT1基因在nDEPs诱导的基因组不稳定性中的作用。此外，研究还通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）精确检测了DNA加合物（如8-OHdG、BPDE-DNA）和DNA甲基化水平（5-mdC），从分子层面揭示了nDEPs的遗传毒性和表观遗传毒性。
3.1. nDEPs暴露48小时后引起细胞凋亡、基因表达改变和DNA损伤
研究人员首先评估了nDEPs的短期细胞毒性。结果显示，在保证细胞存活率高于95%的前提下，48小时暴露虽未引起显著的细胞死亡，但已诱发了浓度依赖性的氧化应激和DNA损伤。基因表达分析发现，与芳烃受体（AHR）信号、NRF2介导的抗氧化防御、DNA损伤修复（如OGG1、XRCC1、ERCC1、XPC）以及细胞存活（MTOR）相关的基因均显著上调。更重要的是，LC-MS/MS检测证实了氧化DNA损伤标志物8-OHdG和PAH代谢产物引起的BPDE-DNA加合物的积累，同时全球DNA甲基化水平（5-mdC）显著下降，提示nDEPs同时引发了遗传和表观遗传层面的改变。
3.2. nDEPs暴露48小时后改变UC-MSC sEV的miRNA谱
在确认细胞应激状态后，研究重点转向了细胞通讯载体——sEVs。研究人员从暴露组和对照组的细胞培养上清中分离出sEVs，并进行了严格的质控。小RNA测序分析发现，nDEPs暴露显著改变了sEVs中的miRNA表达谱。通过多种生物信息学算法交叉验证，最终鉴定出20个差异表达的miRNA，其中hsa-miR-6126、hsa-miR-1246和hsa-miR-1290被一致下调，而hsa-miR-424-5p和hsa-let-7i-5p被一致上调。ddPCR验证进一步确认了hsa-miR-21-5p、hsa-miR-181a-5p和hsa-miR-136-5p等miRNA的表达变化。相关性分析显示，这些差异miRNA的表达水平与8-OHdG、BPDE-DNA加合物和5-mdC水平显著相关，暗示DNA损伤和表观遗传改变与sEVs miRNA谱的重编程存在内在联系。
3.3. 长期nDEPs暴露诱导UC-MSCs衰老
短期暴露已见端倪，长期暴露的后果更为深远。长达14天的暴露时间进程实验表明，nDEPs引发了时间-浓度依赖性的持续性氧化DNA损伤（8-OHdG积累）和炎症反应（NLRP3炎性体激活）。这些持续损伤最终将细胞推向衰老状态：衰老相关β-半乳糖苷酶（SAβG）活性显著升高，细胞形态变得肥大且颗粒感增强。基因表达分析显示，衰老相关标志物P16、P21以及衰老相关分泌表型（SASP）的关键调控因子NFKB1、CEBPB和促炎细胞因子IL1B、IL6、IL8的表达均显著上调，而部分DNA修复基因（如OGG1、XRCC1）的表达在后期受到抑制，这共同促成了不可逆的细胞周期阻滞和衰老状态的建立。
3.4. 衰老的UC-MSCs获得SASP，包括含有改变miRNA的sEVs
细胞衰老不仅意味着细胞自身功能的停滞，更关键的是其会向微环境释放一系列SASP因子。本研究证实，衰老的UC-MSCs确实获得了典型的SASP，表现为培养上清中IL-6和IL-8等促炎细胞因子的分泌量大幅增加。与此同时，NTA分析显示，sEVs的分泌量也随着衰老进程而显著增加。更重要的是，对sEVs中miRNA的持续监测发现，在衰老过程中，hsa-miR-424-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-181a-5p和hsa-miR-136-5p等miRNA在sEVs中的含量持续维持在较高水平，而hsa-miR-1246则呈下降趋势。这表明，nDEPs诱导的衰老细胞不仅分泌更多的sEVs，而且这些sEVs携带了独特的、与衰老相关的miRNA信号。
3.5. nDEPs暴露的UC-MSCs来源的sEVs表现出改变的功能特性
这些被“ reprogrammed”（重编程）的sEVs是否具有功能活性？研究人员进行了功能获得性实验。他们将从nDEPs暴露（短期和长期）的UC-MSCs中提取的sEVs与健康的UC-MSCs共培养。结果发现，这些sEVs能够被受体细胞有效内化，并导致一系列基因表达的显著改变。生物信息学预测和实验验证共同指向，差异表达的sEVs miRNA可能靶向调控MYC、SIRT1、BCL2L11、CDK6、PIK3R1和NFKB1等重要基因。与预测一致，受体细胞在接受sEVs处理后，这些靶基因的mRNA水平普遍下降。功能上，sEVs处理导致受体细胞凋亡率降低，同时细胞周期阻滞在G0/G1期，增殖能力下降——这正是细胞衰老样表型的典型特征。尤为重要的是，来自衰老细胞的sEVs比来自非衰老暴露细胞的sEVs诱导了更显著的效应。
为了深入探究MYC和SIRT1在这一过程中的作用，研究人员采用了siRNA敲降技术。结果显示，单独敲降MYC或SIRT1均会加剧nDEPs暴露引起的端粒缩短，而同时敲降这两个基因则产生协同效应，导致最严重的端粒损伤。这证实了MYC/SIRT1信号轴在维持基因组稳定性中的关键作用，也解释了sEVs中靶向该通路的miRNA改变如何可能介导了毒性效应的传递。
综上所述，这项研究构建了一个从环境暴露到发育毒性的完整信号传递链：纳米尺度的柴油机尾气颗粒（nDEPs）可被脐带间充质干细胞（UC-MSCs）内化，通过诱导氧化应激和DNA损伤，直接导致细胞功能紊乱并最终走向衰老。衰老细胞不仅自身分泌炎性因子，还释放出数量更多、内容物被重编程的小细胞外囊泡（sEVs）。这些sEVs富含特定的miRNA（如hsa-miR-424-5p, hsa-miR-21-5p等），能够被周围健康的干细胞吸收。sEVs中的miRNA通过抑制MYC、SIRT1等关键基因的表达，在受体细胞中引发类似衰老的表型，即增殖能力下降但凋亡抵抗增强，同时伴随端粒功能障碍等基因组不稳定性迹象。这种由sEVs介导的“旁观者效应”或“毒性扩散效应”，可能是环境污染物在胎儿发育过程中放大其危害、影响组织器官正常形成的重要机制。
该研究的发现具有多重重要意义。在理论层面，它首次系统地揭示了交通源超细颗粒物通过sEVs-miRNA轴影响产前干细胞功能的分子机制，为理解环境污染物致发育毒性提供了新的视角和实验证据。在应用层面，研究所鉴定的差异miRNA（如hsa-let-7i-5p, hsa-miR-136-5p等）与孕期空气污染暴露孕妇血浆sEVs中的发现相呼应，提示它们有潜力作为评估孕期污染暴露内暴露剂量和早期健康风险的潜在生物标志物。此外，鉴于脐带间充质干细胞及其sEVs在再生医学中的广泛应用前景，该研究也提醒我们，供体的环境暴露史可能会影响细胞产品的安全性和有效性，为干细胞疗法的质量控制提供了重要参考。未来研究需要进一步在动物模型和人群队列中验证这一机制，并探索干预sEVs介导的毒性传递是否能够减轻环境污染物的发育毒性。
