《Immunology Letters》：Escherichia coli J5-Derived OMVs with Hypoendotoxic LPS: Potential Boosters of T-cell Immunity and IL-17 Production for Enhanced Vaccine Efficacy
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本研究构建了低毒LPS的E. coli J5突变株，发现其OMVs能激活树突状细胞，促进CD4+/CD8+ T细胞增殖分化，增强IL-17分泌，并诱导保护性抗体，优于传统灭活疫苗。
张佳文|支宇航|尹文珠|王海燕|卢宇|马芳|王德云
南京农业大学兽医学院，中国南京210095
摘要
脂多糖（LPS）是大肠杆菌（E. coli）J5（O111:B4）的核心表位，该菌株被用作牛乳腺炎的疫苗。LPS对患有革兰氏阴性菌血症的宿主具有显著的保护作用。然而，LPS仍然是细菌外膜囊泡（OMVs）中的主要毒素，这些囊泡是非复制性的纳米颗粒，能够强烈调节免疫系统。本研究重点探讨了含有五酰基单磷酸脂A的低毒LPS对来自E. coli J5的OMVs的免疫调节作用。含有五酰基单磷酸脂A的OMVs（称为mOMVs）引发了中度的炎症反应。mOMVs的直径仍约为30纳米和100纳米，有助于将抗原输送到淋巴结并呈递给树突状细胞（DCs）。mOMVs可以在注射部位刺激细胞聚集，促进DCs的激活，并增强CD3+ T细胞的增殖以及CD4+和CD8+ T细胞的分化。值得注意的是，由mOMVs激活的CD4+ T细胞产生的IL-17水平较高，这表明可能增强了黏膜免疫力。此外，mOMVs还能引发针对临床分离的大肠杆菌菌株的保护性抗体反应。这些发现表明，脱毒后的LPS使OMVs具有更高的效力和安全性，从而进一步促进了这些囊泡在诱导交叉保护方面的应用。
引言
传染病对全球动物产业构成了严重威胁，而动物产业为人类提供了食物、衣物等产品等重要资源。疫苗可以通过引发即时保护和持久的免疫记忆来诱导宿主的免疫反应，这被认为是最成功的医疗干预措施之一。疫苗效力的限制往往源于某些抗原的免疫原性不足，导致免疫反应不足。为了解决这一挑战，研究人员转向使用免疫佐剂来增强和调节免疫反应[1]。
最近的研究越来越多地将细菌外膜囊泡（OMVs）作为疫苗、递送载体和免疫佐剂的平台。细菌OMVs是由革兰氏阴性细菌自然产生的纳米级囊泡，含有多种病原体相关分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、脂蛋白、DNA、RNA和肽聚糖[2]。OMVs在细菌生理中起着关键作用，无论是致病性细菌还是非致病性细菌，它们都能同时传递毒力因子和抗菌耐药机制[3]。此外，OMVs具有免疫调节功能，可以调节各种成分向受体细胞的递送。由于其小尺寸、非活性特性和天然的抗原构象，OMVs在疫苗开发中具有巨大潜力[4]。例如，自20世纪70年代以来开发的针对脑膜炎奈瑟菌 B型的OMV疫苗，在古巴、挪威和新西兰预防B群脑膜炎（MenB）爆发方面显示出有效性[5]。
与OMVs相关的PAMPs可以启动宿主先天免疫系统的识别和随后的信号级联反应。LPS作为OMVs的主要成分，可以被TLR4识别，触发肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症细胞因子的产生[6]。然而，LPS也被视为一种细菌内毒素，会导致严重的革兰氏阴性菌感染的病理生理效应，这限制了其作为疫苗佐剂的使用[7]。为了解决这些限制，开发了MPL?（Corixa），这是一种含有单磷酸脂A（MPLA）的免疫刺激剂，MPLA是从明尼苏达沙门菌中提取的低毒性LPS衍生物。MPL?被用于人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗[8]。通过基因工程改造产生OMVs的细菌已被证明可以有效降低毒性并增强抗体反应。OMVs可用于接种非细菌抗原，如流感M2e蛋白和SARS-CoV-2刺突蛋白，从而引发强烈的免疫反应[9]。通过删除msbB基因（该基因编码负责在鼠伤寒沙门菌（S. Typhimurium）的脂质A部分添加月桂酸的乙酰转移酶），可以获得低毒性的OMVs[10,11]。
大肠杆菌 J5（E. coli，O111:B4）是一种Rc粗糙突变株。其脂多糖（LPS）的O多糖链不完整，暴露出了保守的核心抗原，这对它对革兰氏阴性菌血症的显著保护作用至关重要[12]。虽然针对O抗原的抗体具有血清型特异性，但J5菌株可以诱导针对共同外膜抗原的交叉反应性免疫球蛋白[13,14]。现有的乳腺炎疫苗基于使用灭活的粗糙E. coli J5作为抗原，旨在促进中性粒细胞的吞噬作用。在发生大肠杆菌乳腺炎的情况下，接种E. coli J5可以减轻乳腺感染的程度和随后的乳汁损失[15]。研究表明，来自E. coli J5菌株的细菌素可以预防由革兰氏阴性菌感染引起的人类致命菌血症[16]。去O-酰基化的J5 LPS与B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白非共价结合，形成一种疏水复合物，从而提高溶解度和递送效率，保护动物免受实验性败血症的侵害[17]。
革兰氏阴性细菌的Rc粗糙突变株能够诱导针对共同抗原的交叉反应性抗体[18]。因此，E. coli粗糙菌株J5作为佐剂具有潜力，尤其是其纳米级的OMVs。在我们之前的研究中，我们构建了一种E. coli J5突变株ΔJ5（J5ΔlacI::lpxEΔlpxM），通过用Francisella novicida的lpxE基因替换lacI基因来实现这一改造。这一修改旨在降解脂质A分子C1位置的磷酸基团。此外，删除J5菌株中的lpxM基因可以防止在脂质A分子的C3’位置添加十四个碳酰基链，最终产生五酰基单磷酸脂A（见补充图S1和S2）。基于此，本研究旨在探讨通过加入五酰基单磷酸脂A来修饰LPS是否会影响来自E. coli J5疫苗菌株的OMVs的免疫调节特性。这一探索可能为优化细菌OMVs在疾病预防和治疗领域的应用提供重要见解。
细菌菌株、细胞和动物
野生型大肠杆菌 J5（O111:B4）菌株由扬州大学的朱国强教授提供。E. coli J5突变株ΔJ5是在我们实验室构建和保存的，它产生的LPS含有五酰基单磷酸脂A，其OMVs被称为mOMVs。临床上的大肠杆菌菌株是从江苏省某牛群中患有乳腺炎的牛身上分离得到的[19]。细菌菌株在37°C下于Luria-Bertani（LB）培养基（hopebio）中摇动培养。
牛乳腺上皮细胞
含有五酰基MPLA的生物工程mOMVs的特性
从野生型大肠杆菌 J5（wtOMV）和突变株ΔJ5（mOMV）中提取的OMVs在形态、内毒素活性和大小方面进行了表征。透射电子显微镜（TEM）图像显示，OMVs具有双层结构，呈圆形，大小不一（图1A）。使用LAL试剂盒测量内毒素活性，25 μg的wtOMVs和mOMVs的内毒素活性约为wtOMVs的1/10（图1B）。wtOMVs和mOMVs的平均直径分别为
讨论
牛乳腺炎是乳制品行业中最为普遍且经济负担最重的疾病之一。近年来，围绕大肠杆菌 J5菌株开发并实施了多种商业疫苗，包括J-VAC、Endovac-Bovi、Startvac和Mastivac，用于预防和控制牛乳腺炎[23]。这些疫苗的核心机制是利用LPS作为主要抗原来激活宿主的免疫系统
伦理批准
所有动物实验均遵循动物福利标准进行，并获得了中国江苏省农业科学院动物实验伦理委员会的批准（批准编号SYXK(Jiangsu) 2020-0024）。
CRediT作者贡献声明
张佳文：概念提出、研究、数据整理、审稿与编辑。支宇航：研究、数据整理。尹文珠：资源提供、软件使用、资金获取。王海燕：数据整理、资金获取。卢宇：数据分析。马芳：概念提出、数据整理、监督、项目管理、写作-审稿与编辑、资金获取。王德云：项目管理、写作-审稿与编辑。
资助
本工作得到了江苏省科学技术协会青年科技人才支持项目（JSTJ-2024-114）和江苏省自然科学基金（BK20241181, BK20221431）的支持。
数据可用性
本研究中的数据可在文章和补充材料中找到。CRediT作者贡献声明
张佳文：写作-审稿与编辑、研究、数据整理、概念提出。支宇航：研究、数据整理。尹文珠：软件使用、资源提供、资金获取。王海燕：资金获取、数据整理。卢宇：数据分析。马芳：写作-审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、数据整理、概念提出。王德云：写作-审稿与编辑、项目管理。
