《Journal of Advanced Research》：Nrf2 deficiency in myeloid cells accelerates atherosclerosis by promoting the inflammatory response and impairing efferocytosis
编辑推荐：
本研究针对巨噬细胞中核因子E2相关因子2（NRF2）在动脉粥样硬化（AS）中的确切作用尚不明确的问题，开展了髓系细胞特异性Nrf2敲除对ApoE?/?小鼠动脉粥样硬化影响的主题研究。结果发现，髓系细胞Nrf2缺失会加剧炎症反应并损害巨噬细胞对凋亡细胞的清除（胞葬作用），从而加速动脉粥样硬化病变。研究进一步揭示Nrf2通过直接结合并调控非肌肉肌球蛋白重链IIA（Myh9）的表达来影响胞葬作用的新机制，并证实药物激活NRF2可缓解病变。该研究阐明了巨噬细胞NRF2在动脉粥样硬化中的关键保护作用，为治疗策略提供了新靶点。
心血管疾病是人类健康的头号杀手，而动脉粥样硬化病变是大多数心血管事件的共同病理基础。尽管在针对炎症和脂蛋白代谢的治疗方面取得了进展，但患者的残余心血管风险仍然很高。动脉粥样硬化是一种动脉慢性炎症性疾病，涉及多种细胞类型，其中巨噬细胞是病变的主要组成部分，在疾病发展中起关键作用。在动脉粥样硬化发生的早期，内皮细胞功能障碍上调粘附分子的表达，吸引循环单核细胞进入动脉并分化为巨噬细胞。过量的脂质摄取使巨噬细胞转化为充满脂质的泡沫细胞，这些细胞作为坏死和凋亡细胞积累形成坏死核心。胞葬作用是动脉粥样硬化病变内凋亡细胞被吞噬清除的复杂过程。胞葬作用不足会导致凋亡细胞积累，促进坏死核心形成，并加重炎症和动脉粥样硬化病变。
核因子E2相关因子2（NRF2）是CNC-bZIP家族成员，调节抗氧化和抗炎反应。然而，NRF2在动脉粥样硬化发展中既表现出促动脉粥样硬化作用，也表现出抗动脉粥样硬化作用。先前研究表明，全身性Nrf2敲除会减轻ApoE?/?小鼠的动脉粥样硬化。与此形成鲜明对比的是，血管内皮细胞特异性敲低Nrf2以及将Nrf2缺陷的骨髓细胞移植到受体小鼠中会产生相反的效果。这些发现表明NRF2在动脉粥样硬化中发挥细胞和/或组织特异性作用。然而，NRF2在巨噬细胞中对动脉粥样硬化发展的作用及其确切机制仍不清楚。
发表在《Journal of Advanced Research》的这项研究旨在探究髓系细胞中Nrf2在动脉粥样硬化发展中的作用，并深入揭示其潜在机制。
研究人员综合利用了生物信息学分析、基因工程动物模型、细胞生物学、分子生物学等多种技术方法。关键方法包括：对公共数据库（GEO、DDBJ）中的人和小鼠动脉粥样硬化单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、芯片数据、批量RNA测序（RNA-seq）数据和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据进行重新分析；构建了髓系细胞特异性Nrf2基因敲除（Nrf2(M)-KO）的ApoE?/?小鼠模型；通过组织染色（如Oil Red O、HE、Masson、免疫组化/荧光）、超声检测、流式细胞术等评估动脉粥样硬化病变、炎症、氧化应激和胞葬作用；在体外培养的原代巨噬细胞（腹腔巨噬细胞、骨髓来源巨噬细胞）和细胞系（RAW264.7, THP-1）中，利用小分子抑制剂（ML385）、激活剂（4-辛基衣康酸，4-octyl itaconate）、基因敲低（shRNA）、过表达、染色质免疫沉淀PCR（ChIP-PCR）等技术探讨机制；并整合了转录组学（RNA-seq）和蛋白质组学（数据非依赖采集质谱，DIA-MS）数据进行通路富集和关键分子筛选。
NRF2在动脉粥样硬化动脉巨噬细胞中上调
研究人员首先通过分析人类颈动脉内膜切除术标本的单细胞RNA测序数据发现，与邻近正常组织相比，动脉粥样硬化核心区域的巨噬细胞比例显著增加，并且NRF2及其下游基因的活性显著上调。对小鼠动脉粥样硬化模型的单细胞数据分析也得到一致结果。体外实验证实，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）刺激能诱导原代巨噬细胞中NRF2蛋白表达增加及其核转位，并上调其下游靶基因的表达。这些结果表明，NRF2在动脉粥样硬化病变的巨噬细胞中被激活。
髓系细胞Nrf2基因缺失加重动脉粥样硬化病变
为了研究巨噬细胞中NRF2在动脉粥样硬化中的具体作用，研究人员构建了髓系细胞特异性Nrf2敲除的ApoE?/?小鼠模型（Nrf2(M)-KO; ApoE?/?）。研究发现，与对照组相比，髓系细胞特异性缺失Nrf2的小鼠其全身主动脉和主动脉根部的动脉粥样硬化病变面积显著增大，坏死核心面积增加，纤维帽变薄，斑块不稳定性指数升高。然而，两组小鼠的体重、血压、血脂水平、血糖等代谢参数无显著差异。这表明髓系细胞Nrf2缺失所加重的动脉粥样硬化独立于系统脂质代谢水平。
Nrf2缺失促进动脉粥样硬化病变中巨噬细胞积累和炎症
进一步机制探索发现，Nrf2缺失小鼠的动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞（F4/80阳性）积聚增多。虽然血清中炎症因子水平无显著变化，但斑块局部白细胞介素-1β（IL-1β）表达升高，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）从细胞核向细胞质的易位（释放）增加，并且斑块内的活性氧（ROS）和线粒体ROS水平也升高。这表明Nrf2缺失主要在病变局部加剧了炎症反应和氧化应激。
Nrf2缺失对巨噬细胞泡沫细胞形成的影响
研究人员探讨了Nrf2缺失是否影响巨噬细胞的脂质摄取和泡沫细胞形成。体外实验表明，尽管Nrf2缺失影响了部分脂质摄取受体（如CD36下调，SR-A和LOX-1上调）和胆固醇流出受体（SR-B1下调）的mRNA表达，但原代巨噬细胞在oxLDL刺激下形成泡沫细胞（Oil Red O染色阳性）的能力以及摄取荧光标记的修饰LDL的能力在基因敲除组和对照组间无显著差异。巨胞饮作用相关关键分子的表达也无差异。这表明Nrf2缺失可能不是通过改变巨噬细胞脂质代谢能力来影响动脉粥样硬化。
Nrf2缺失导致巨噬细胞胞葬作用受损
由于斑块内巨噬细胞积聚增加但泡沫细胞形成无显著变化，研究人员推测巨噬细胞的吞噬功能可能受损。胞葬作用是巨噬细胞清除凋亡细胞的关键过程。体内实验显示，Nrf2缺失小鼠主动脉根部的凋亡细胞（TUNEL阳性）增多，但被巨噬细胞关联的凋亡细胞比例下降，表明胞葬作用效率降低。体外共培养实验直接证实，Nrf2基因敲除或使用NRF2抑制剂ML385处理的原代巨噬细胞，其吞噬凋亡胸腺细胞的能力显著下降。这证明Nrf2缺失损害了巨噬细胞的胞葬功能。
Nrf2缺失损害巨噬细胞肌动蛋白细胞骨架动力学
为了阐明胞葬作用受损的分子机制，研究人员对oxLDL刺激下的原代巨噬细胞进行了转录组学和蛋白质组学分析。基因集富集分析（GSEA）显示，Nrf2缺失导致与肌动蛋白细胞骨架重组、肌动蛋白丝结合以及Rho GTP酶信号通路相关的基因集显著下调。蛋白质组学结果同样表明，下调的差异表达蛋白富集于吞噬作用、肌球蛋白II复合物等通路。通过整合两组学数据，研究人员筛选出10个在mRNA和蛋白水平均下调的重叠分子，其中非肌肉肌球蛋白重链IIA（MYH9）是唯一与胞葬作用相关的分子。免疫荧光实验观察到，在胞葬过程中，Nrf2缺失的巨噬细胞其MYH9在吞噬杯处的募集减少。尽管Rho GTP酶通路被富集，但RAC1/CDC42的总蛋白和磷酸化水平及其在斑块巨噬细胞中的共表达均未改变。
Nrf2缺失主要通过下调Myh9损害巨噬细胞胞葬作用
机制上，研究人员通过分析公共数据库和ChIP-PCR实验证实，Nrf2能够直接结合到Myh9基因的启动子区域。在动脉粥样硬化斑块中，Nrf2缺失小鼠的巨噬细胞（CD68阳性）中MYH9阳性的细胞比例降低。对人类数据的再分析发现，NRF2高表达的巨噬细胞亚群同时伴有MYH9高表达，并且晚期内体通路富集，提示其胞葬能力更强。这些结果确立了Nrf2对Myh9的直接转录调控关系。
衣康酸激活NRF2信号抑制炎症并增强胞葬作用
最后，研究人员探讨了药物激活NRF2的治疗潜力。使用NRF2激活剂4-辛基衣康酸处理巨噬细胞，可诱导NRF2核转位，上调其下游靶基因以及Myh9的表达，并抑制LPS诱导的炎症因子产生。重要的是，衣康酸处理促进了MYH9在吞噬杯处的定位，并显著增强了巨噬细胞对凋亡细胞和凋亡泡沫细胞的胞葬能力。在体实验也观察到衣康酸预处理能提高小鼠腹腔巨噬细胞的胞葬效率。然而，在Nrf2敲低的巨噬细胞中，衣康酸既不能上调Myh9表达，也无法挽救其胞葬缺陷。而在这类细胞中过表达Myh9则能恢复胞葬功能。这证明衣康酸通过Nrf2依赖性方式上调Myh9，进而增强胞葬作用。
研究结论与意义
本研究深入揭示了髓系细胞（主要是巨噬细胞）中NRF2在动脉粥样硬化中的关键保护作用及其新颖机制。研究发现，巨噬细胞NRF2通过直接调控Myh9的表达，影响巨噬细胞在胞葬过程中肌动蛋白细胞骨架的重排和吞噬杯的形成，从而保障凋亡细胞的有效清除。髓系细胞Nrf2缺失会破坏这一过程，导致凋亡细胞积累、坏死核心扩大、局部炎症加剧，最终加速动脉粥样硬化进展并增加斑块不稳定性。
该研究的创新性和重要意义在于：首先，明确了巨噬细胞NRF2在动脉粥样硬化中的细胞特异性保护作用，澄清了此前全身性敲除模型带来的困惑；其次，首次将NRF2与肌动蛋白细胞骨架调控分子MYH9联系起来，揭示了“NRF2-MYH9-胞葬作用”这一全新的信号轴，深化了对胞葬作用调控机制的理解；最后，通过药理实验证明激活NRF2（如使用衣康酸衍生物）不仅能抑制炎症，还能增强胞葬作用，具有双重获益的潜力，为动脉粥样硬化的防治提供了新的策略和靶点。
这项研究将动脉粥样硬化中的炎症反应和胞葬作用缺陷这两个关键病理环节通过NRF2-MYH9轴联系起来，为理解疾病发病机制和开发新的治疗手段提供了重要的理论依据和实验证据。
