一种新型固氮细菌（Ochrobactrum anthropi CGMCC 1.17249）对氟尼卡胺及其酰胺的生物降解作用：降解途径、特性、基因组特征、酶促机制及固定化应用

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Biodegradation of flonicamid and its amide by a novel nitrogen-fixing bacterium Ochrobactrum anthropi CGMCC 1.17249: pathways, properties, genomic features, enzymatic mechanism and immobilization application

生物降解氟虫腈（FLO）及其代谢物TFNG-AM的研究：发现Ochrobactrum anthropi CGMCC 1.17249能高效降解FLO至TFNG，并鉴定新型酰胺酶AmiA，证实固定化工程细胞/酶可有效降解TFNG-AM。

　　

蒋火勇|陈雪|吴洪凯|孙文豪|丁建军|杨文龙|戴一军

江西农业大学生物科学与生物工程学院，南昌330045，中华人民共和国

摘要

杀虫剂氟啶虫胺（FLO）及其酰胺代谢物N-(4-三氟甲基烟酰)甘氨酰胺（TFNG-AM）经常在收获的作物中被检测到，对环境和动物健康构成风险。在污染物处理中，固定化生物催化剂更受欢迎。然而，目前尚未研究Ochrobactrum菌株对FLO和TFNG-AM的生物降解作用，以及固定化生物催化剂对TFNG-AM的降解作用。本研究分离出一种新型细菌Ochrobactrum anthropi CGMCC 1.17249，该菌能够高效地将FLO降解为TFNG-AM，进而降解为4-(三氟甲基)烟醇甘氨酸，在10天内可消除91.4%的FLO（0.92 mmol/L），在8天内可消除17.7%的TFNG-AM（0.88 mmol/L）。值得注意的是，晚对数期细胞的FLO降解活性是中对数期细胞的23.4倍。基因组分析表明，O. anthropi CGMCC 1.17249具有多种参与多种污染物降解的途径。一种受生长阶段调控且依赖Co2?的降解酶（非腈水合酶）可能介导FLO向TFNG-AM的降解。TFNG-AM进一步降解为TFNG的过程由一种新的酰胺酶AmiA催化，该酶在所有已知的TFNG-AM降解酶中具有最高的热稳定性。关键残基（128Y、129G、177S、296V、301I、302G、327R）对AmiA高效识别和降解TFNG-AM至关重要。这是首次利用固定化工程细胞/酶实现TFNG-AM的有效降解。本研究加深了对FLO/TFNG-AM生物降解机制的理解，并为污染物修复提供了新的生物催化剂。

引言

氟啶虫胺（FLO）是一种含有腈基的杀虫剂，主要用于防治半翅目害虫，广泛应用于茶叶、棉花和蔬菜[1]、[2]、[3]。然而，FLO及其酰胺代谢物N-(4-三氟甲基烟酰)甘氨酰胺（TFNG-AM）和4-三氟甲基烟酰胺（TFNA-AM）在多种收获作物中的残留浓度高达0.04–0.25 mg/kg[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。这些残留物可能进入食物链，已在动物血清和尿液中检测到[9]、[10]。施用杀虫剂后，大量FLO会进入土壤和水生环境。在土壤中，FLO的残留浓度可达53.3 μg/kg，半衰期为0.7–1.8天；TFNG-AM的残留浓度为5.9 μg/kg，半衰期为0.2–1.0天。相比之下，FLO在表面水中的持久性更强，浓度为79.2 μg/kg，半衰期为30.0–37.0天。在沉积物中，FLO的残留浓度为12.9 μg/kg，半衰期为35.7–43.6天[8]。FLO对有益生物如Episyrphus balteatus、Chrysoperla carnea和Nesidiocoris tenui具有生态毒性[11]、[12]，在高浓度（10 mg/kg）下还表现出基因毒性[13]。鉴于其对环境和动物的危害，亟需开发有效的FLO及其代谢物降解策略。

微生物降解是一种高效、经济且环保的农药修复方法[14]。先前的研究已鉴定出多种能够降解FLO的微生物菌株，包括Alcaligenes faecalis、Microvirga flocculans、Variovorax boronicumulans、Ensifer meliloti、Ensifer adhaerens、Aminobacter属菌株和Pseudomonas stutzeri[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。这些菌株通过两种酶途径降解FLO：M. flocculans、P. stutzeri、E. adhaerens、Aminobacter属菌株和E. mellioti中的腈水合酶途径将FLO水解为TFNG-AM[15]、[18]、[21]；而A. faecalis和V. boronicumulans则通过腈酶途径直接将FLO水解为TFNG-AM和4-(三氟甲基)烟醇甘氨酸（TFNG）[18]、[19]、[20]。随后，M. flocculans和V. boronicumulans中的特定酰胺酶促进了TFNG-AM的进一步降解[16]、[22]。参与FLO降解的关键酶包括钴型腈水合酶、双功能腈酶以及Asp-tRNA^Asn/Glu-tRNA^Gln酰胺转移酶A亚基（GatA）类酰胺酶[18]。值得注意的是，很少有菌株同时具备降解FLO和TFNG-AM的能力。

许多Ochrobactrum anthropi菌株具有降解多种污染物的能力。例如，O. anthropi SH14能有效降解常用的strobilurin类杀菌剂azoxystrobin[23]。Ermakova等人[24]报道，O. anthropi GPK 3能有效降解含有稳定碳-磷共价键的有机磷化合物。从纺织废水中分离出的O. anthropi S1可快速降解活性黑5和Cr(Ⅵ)[25]。O. anthropi HND19通过异养硝化和好氧反硝化作用去除NH??-N和NO??-N，且不会产生NO??-N[26]。此外，由O. anthropi IITR07和其他四种细菌组成的联合菌群能有效降解原油中的多种多环芳烃[27]。然而，目前尚未发现能够同时降解FLO和TFNG-AM的O. anthropi菌株，因此其降解机制尚不清楚。

与自由细胞相比，固定化细胞更易于重复使用，且更能耐受恶劣环境，在废水处理领域受到越来越多的关注[28]。例如，海藻酸钙固定的E. adhaerens能有效降解表面水中的FLO[17]。表达腈水合酶和钴转运蛋白的固定化工程大肠杆菌在酸性、碱性和高温环境中具有更强的降解能力[29]。此外，表达异源酰胺酶的固定化工程假单胞菌即使在80°C下也能快速降解TFNA-AM[28]。然而，固定化生物催化剂（如整个细胞和酶）对TFNG-AM的降解作用尚未被研究。

本研究分离并鉴定出一种新型固氮菌株O. anthropi CGMCC 1.17249，该菌株能够降解FLO和TFNG-AM，并阐明了其降解途径。评估了预培养条件（如培养时间、金属离子和营养浓度）对FLO和TFNG-AM降解的影响。通过基因组分析鉴定出降解酶AmiA，并对其进行了生化和结构表征。通过分子对接、分子动力学模拟和定点突变研究了AmiA与TFNG-AM之间的相互作用。最后，评估了固定化工程大肠杆菌/AmiA对TFNG-AM的降解效果。这项研究增强了我们对FLO和TFNG-AM生物修复机制的理解，并为废水处理提供了高效的生物催化剂。

化学物质和培养基

FLO（纯度97%）购自中国常熟恒耀新材料有限公司。TFNG-AM（纯度97%）由江苏省微生物与功能基因组学重点实验室制备，详细制备过程见补充材料。TFNA-AM（纯度98%）购自中国武汉湖北诺纳科技有限公司。吲哚-3-乙酰胺、尿素、苯甲酰胺、谷氨酰胺、天冬酰胺和烟酰胺（纯度均为95%）购自Sigma-Aldrich（上海）。

FLO降解菌的分离与鉴定

分离出许多具有不同菌落形态和大小的菌株，但只有O. anthropi CGMCC 1.17249表现出较高的FLO降解活性。在LB琼脂平板上，O. anthropi CGMCC 1.17249的菌落呈圆形、隆起、白色不透明、湿润且边缘光滑（图S1A）。该菌株具有运动能力，能液化明胶并产生硫化氢。其尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶活性呈阳性，但碳水化合物发酵和甲基红试验呈阴性。

结论

一种新型分离菌株O. anthropi CGMCC 1.17249能够高效地将FLO降解为TFNG-AM，后者进一步降解为TFNG。据我们所知，这是首次报道Ochrobactrum菌株同时降解FLO和TFNG-AM。值得注意的是，FLO向TFNG-AM的降解具有显著的生长阶段依赖性，晚对数期细胞的降解活性是中对数期细胞的23.4倍。这一过程可能由受生长阶段调控的酶介导。

CRediT作者贡献声明

陈雪：数据可视化、验证、方法学、数据管理。蒋火勇：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件应用、方法学研究、资金获取、数据管理、概念构思。孙文豪：数据可视化、软件应用、方法学研究、数据管理。吴洪凯：验证、软件应用、方法学研究、数据管理。杨文龙：软件应用、方法学研究、数据管理。丁建军：数据可视化、软件应用、方法学研究。戴一军：写作——审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号31970094）、江西省青年科技人才培养项目（项目编号20252BEJ730049）、江西省教育厅自然科学基金（项目编号GJJ2500306）和山东省自然科学基金（项目编号ZR2024MD104）的支持。本研究中的分子动力学模拟工作得到了