《Journal of Hazardous Materials》：Dicyanoisophorone-based near-infrared fluorescent probe with a large Stokes shift for the detection and bioimaging of hydrazine
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近红外荧光探针HB快速高灵敏度检测联氨并成功应用于细胞和动物模型成像，特别监测异烟肼代谢产生的内源性联氨，同时适用于环境检测。
夏宏成|张宇航|吕丽明|韩迪|杨宏坤|严慧娟|吕洁莉|林俊堂|孔莹莹
新乡医学院药学院，中国河南省新乡市453003
摘要
肼（N?H?）是一种无色液体，具有强烈的还原性，在航空航天、化工和制药行业中得到广泛应用。然而，使用N?H?会引发环境污染和生物毒性，因此对其检测至关重要。在本研究中，我们利用二氰异佛尔酮作为荧光团，乙酰基作为反应位点，构建了一种近红外荧光探针HB。该探针对N?H?表现出快速（12分钟）且灵敏（检测限为31纳摩尔）的响应特性，其较大的斯托克斯位移使其适用于生物成像。该探针成功且快速地检测到了细胞中的外源性N?H?，并能够成像由异烟肼代谢产生的内源性N?H?。此外，它还能实现斑马鱼体内N?H?的3D立体成像，并检测到小鼠体内的内源性和外源性N?H?。特别是，该探针可用于成像肾脏和肝脏中由异烟肼代谢产生的N?H?，以监测药物代谢过程。结合各种荧光检测设备，HB探针在环境检测和体内药物代谢监测方面具有广泛的应用前景。
引言
肼（N?H?），又称二胺，是一种由两个氨基相连组成的简单小分子化合物[1]。由于其高能量值，N?H?被广泛应用于电池行业[2]，并用作发动机和火箭燃料[3]。在适当条件下，N?H?容易被氧化并表现出强烈的还原性[4]，因此广泛用于除草剂[5]、杀虫剂[6]、天然产物[7]和药物[8]的合成。例如，异烟肼[9]、肼嗪[10]和卡比多巴[11]等药物中都含有肼结构。由此可见，N?H?具有重要的工业价值。然而，N?H?是一种极具毒性的物质，会对人类健康和环境造成不可逆的损害[12]。例如，作物暴露于N?H?会导致叶片枯萎、抑制植物幼苗生长，并通过食物链对人类和动物造成伤害[13]。长期接触N?H?会刺激呼吸系统，引起头晕和恶心，并导致肝毒性和肾毒性[14][15]。此外，N?H?是一种潜在的致癌物，根据美国环境保护署的规定，其阈值为10 ppb（0.31微摩尔）[16]。监测环境样品中的N?H?有助于及时采取有效措施，减少其带来的环境危害。在生物系统中检测N?H?对于N?H?的毒理学和药理学研究尤为重要。
N?H?在工业使用过程中的泄漏、含有N?H?的废水排放，以及人体内药物代谢产生的内源性N?H?都可能带来潜在危害。因此，开发一种能够检测环境样品中N?H?的方法，并追踪生理环境中由药物代谢产生的N?H?显得十分紧迫。传统的检测方法（如色谱法[17]、质谱法[18]和电催化法[19]）在复杂样品中无法充分检测N?H?，且受到昂贵仪器、复杂制备步骤、严格实验条件和操作技能的限制[1]。此外，N?H?的体内检测能力也有限[20]。因此，亟需开发低成本的分析方法和更具生物相容性的检测方法[21][22]。凭借其结构多样性、易于修饰和操作、成本效益高、现场检测和实时信息获取能力，以及适用于生物和环境检测的非破坏性成像优势，荧光技术受到了关注，已被用于N?H?的检测[25]。如图1所示，N?H?检测探针的设计策略主要集中在三种方法上：1）脱保护反应，包括与乙酸酯[26]、4-溴丁酸酯[27]、丙酮酸酯[28]、二羧酰胺[29][30]和芳基酯[31][32][33]的反应；2）腙的形成反应，包括与醛[34]、亚胺[35]、氰基取代基[36][37][38]、1,3-茚二酮[39][40][41]和巴比妥酸衍生物[42][43]的反应；3）环闭合反应，形成吡唑[44][45]和吡嗪[46]环。尽管这些荧光探针（见表S1，支持信息）在缓解N?H?检测紧迫需求方面取得了一定进展，但仍存在响应速度慢[34][40]、合成难度大[41]、发射波长短[36][38][39]和斯托克斯位移小[39]等缺点，限制了其在生物成像中的广泛应用。在这些设计概念中，最理想的修饰方法是使用N?H?对含有羟基作为反应位点的荧光团进行乙酰化修饰。乙酰化修饰比其他方法更简单、成本更低，能够设计出发射波长较长的近红外（NIR）探针，其对N?H?的响应机制直观明了。此外，传感产物可以直接转化为荧光团，转化率高于基于脱保护的其他方法[26][27][28]，便于探索和验证相关机制。利用N?H?的亲核取代性质实现了荧光团的荧光释放。二氰异佛尔酮荧光团具有近红外发射波长和较大的斯托克斯位移，保证了出色的成像性能。我们的目标是利用这些特性开发一种用于环境和生物样品中N?H?检测的方法。
在本研究中，我们基于二氰异佛尔酮荧光团构建了具有不同邻位取代基的乙酸酯荧光探针（HH、HB和BB），用于检测N?H?。通过用邻位取代的溴原子修饰荧光团上乙酰基与芳环平面之间的二面角，降低了共轭程度，使乙酰基更容易受到N?H?的攻击和脱离。在邻位进行双重取代会使探针在溶液中的稳定性降低，因为这会导致乙酰基与芳环平面之间的二面角变为89°。相反，单个邻位取代的溴原子会提高探针与N?H?的反应速率。分析了取代基的影响，并实现了溶液中N?H?的快速检测。HB探针优异的近红外性能和较大的斯托克斯位移使其能够实现有效的荧光成像，成功检测到了细胞和斑马鱼中的外源性N?H?。此外，该探针还成功检测到了细胞和小鼠体内由异烟肼代谢产生的内源性N?H?，证明了其检测药物代谢产生的内源性N?H?的能力。
材料与仪器
所有用于合成的化学试剂均从试剂供应商处购买，使用前无需进一步纯化。合成过程中，化合物使用200–300目硅胶进行纯化。流动相由分析级乙酸乙酯和石油醚组成。实验中使用的去离子水通过RephiLe水纯化系统进行纯化。核磁共振（NMR）数据使用Bruker AV400 NMR光谱仪（400 MHz）获得：1H NMR在400 MHz下进行。
探针的合成
探针及相关化合物的合成步骤见图2。以二氰异佛尔酮为起始材料，与不同的对羟基苯甲醛发生缩合反应，得到荧光团HH-OH、HB-OH和BB-OH。随后这些荧光团分别与酰氯反应，生成探针HH、HB和BB。通过1H NMR、13C NMR、HRMS和FT-IR光谱分析对其结构进行了表征。
结论
我们构建了三种基于二氰异佛尔酮荧光团的探针。未取代的HH探针对N?H?的响应较慢，而溴原子的邻位取代使得乙酰基与芳环平面之间的二面角增大，从而提高了探针HB对N?H?的响应速率并使传感产物的发射波长红移。然而，邻位双取代的溴原子降低了探针的稳定性。
环境影响
肼（N?H?）的广泛应用推动了工业发展和人类文明的进步。然而，N?H?在工业使用过程中的泄漏及其所含废水的排放会对人类和环境造成危害。肼污染物进入氮循环并在动物和人体内积累，导致不可逆的影响。因此，实现溶液中N?H?的检测及其在生物体内的成像具有重要意义。
作者贡献声明
孔莹莹：撰写初稿、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。杨宏坤：验证、数据管理。严慧娟：资源获取、资金获取。吕洁莉：方法学研究、实验研究。林俊堂：撰写、审稿与编辑、项目管理、实验研究、资金获取。夏宏成：撰写初稿、方法学研究、数据分析、概念构思。张宇航：实验研究、数据分析
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
我们感谢河南省自然科学基金（252300421458、252300421635）、河南省科技研发计划联合基金（235101610002）和河南省高等学校重点科研项目（25B150010）的财政支持。
