建立了TaqMan qPCR方法，用于鉴定和定量含有Amynthas aspergillum的药用产品

《Microchemical Journal》：The establishment of TaqMan qPCR method for the identification and quantification of Amynthas aspergillum originated medicinal products

广地龙（GDL）来源鉴定与掺假检测研究建立双探针TaqMan qPCR方法，特异性检测新亚群及 Earthworm-universal 16S rRNA，灵敏度达0.0001 ng/μL，验证应用于药片、汤剂等复杂基质，含量范围0.07%-62.42%，与ddPCR吻合度(r=0.9988)，填补传统中药质量控制空白。

　　

段书晨|张文娟|吴哲|程贤龙|马思宇|李萍|魏峰

中国国家食品药品监督管理局中药民族药质量控制研究所，北京102629

摘要

“广地龙”（GDL，学名：Amynthas aspergillum）是传统中药中的一种药典规定的“地龙”（DL，学名：Pheretima）来源，但其存在被多种蚯蚓种类掺假的普遍现象。为了能够对干燥和高度加工的药品中的GDL进行特异性和精确的定量分析，我们建立了一种基于TaqMan qPCR的检测方法，该方法针对物种特异性序列（包括新分类的GDL亚群）以及适用于所有蚯蚓的通用序列，且扩增产物长度较短（<100 bp）。该方法在特异性（测试了7个物种）、灵敏度（LOD = 0.0001 ng/μL）、扩增效率（100.16%）和重复性（日间精密度CV < 1.6%）方面均通过了验证。在不同条件下比较了两种相对定量方法（ΔCT和ΔΔCT）的准确性。ΔCT方法适用于均匀性较高的样本，而ΔΔCT方法通过动态归一化处理，提高了复杂样品中的检测准确性和稳健性。对于配方颗粒和煎剂样品，定量偏差保持在±18%范围内。对于小活络丸，GDL的含量范围为0.07%至62.42%，与滴式数字PCR检测结果高度一致（r = 0.9988，P < 0.0001）。这是首次在煎剂及其下游产品（包括高度加工和成分复杂的制品）中鉴定和定量GDL来源的研究，证明了该方法在整个产品链中验证GDL真伪的强大适用性。

引言

蚯蚓，也称为Pheretima或地龙（DL），是一种多功能资源，在食品和传统中药（TCM）中都有应用，具有抗凝、溶栓、抗氧化、止咳和平喘等药理活性[[1], [2], [3], [4], [5]]。根据《中国药典》（2025年版），Amynthas aspergillum（Perrier, 1872）、Metaphire vulgaris（Chen, 1930）、M. guillelmi（Michaelsen, 1895）和A. pectieniferus（Michaelsen, 1931）被正式列为“地龙”的药用来源。其中最常用的是A. aspergillum（广地龙，GDL），主要分布于中国广西壮族自治区、广东省和海南省，同时在福建省和云南省以及越南也有少量分布[6]。最新的系统发育证据表明，A. aspergillum内部存在显著的遗传差异，形成了不同的亚群[7,8]。

药用Pheretima资源主要依赖野外采集，人工繁殖技术尚未得到充分发展。近年来，对Pheretima药材的需求激增，导致了供需矛盾，进口量增加。据报道，市售的Pheretima药材来源于至少34个物种，包括非药典规定的品种如M. magna、A. carnosus和M. tschiliensis[9]。由于煎煮、加工和储存过程中的形态变化及化学变化，原产地鉴定变得更加困难。

目前，已有基于质谱的特征肽分析[10,11]和UPLC氨基酸指纹图谱[12]等方法用于Pheretima的 authenticity评估。但这些方法在处理复杂多组分制剂时存在局限性。传统的DNA鉴定技术如LAMP、DNA条形码和常规PCR[8,[13],[14],[15]通常不适用于深度加工的产品或制剂，因为它们的灵敏度较低，扩增产物较长（>200 bp），或者容易受到混合物中其他成分的干扰。特别是新定义的A. aspergillum亚群之间的遗传变异可能导致现有方法无法检测到这些亚群。此外，缺乏精确的定量方法，这对于混合原料、配方颗粒和制剂尤为重要。

本研究建立了一种双链TaqMan实时定量PCR（qPCR）方法，通过设计针对A. aspergillum两个亚群的物种特异性探针（靶向线粒体COI）和通用探针（靶向16S rRNA）来检测和定量GDL。该方法在包括原料混合物、配方颗粒和制剂在内的复杂样品中均表现出良好的适用性。我们进一步测试了两种相对定量策略（ΔCT和ΔΔCT）以检测混合样品中的掺假情况。共检测了34个样本，其中14个含有GDL，20个不含GDL，以验证方法的特异性；同时准备了含有GDL与其他蚯蚓物种混合的参考模型混合物（DNA溶液和粉末），以便进行精确的定量评估。通过同时扩增内源性参考基因和目标基因实现了归一化校正，确保了定量结果的准确性。为了验证实际应用效果，该方法被应用于多种GDL衍生产品，包括商业原料药、制备切片、煎剂、配方颗粒和中成药，证明了定量分析的可靠性和适用性。因此，本研究填补了GDL质量控制方面的空白，为A. aspergillum来源的中药产品提供了一种稳健且特异的定量方法。

仪器和试剂

实时荧光定量PCR仪（qPCR-Analytik jena qTOWER3G、Roche LightCycler?480II、Aperbio Pangaea Real-Time PCR System）、数字PCR系统（DQ24、Sniper）、Qsep100 Bio-Fragment Analyzer（Bioptic）、分析天平（Mettler AB135-S）、超纯水系统（Millipore）、球磨机（MM400、Retsch）、NanoDrop One超微量分光光度计（ThermoFisher Scientific）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf Centrifuge 5427 R）、微量离心机（IKA mini G S025）、搅拌器

探针/引物设计与选择

选择细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因作为物种特异性探针/引物的设计依据，因为该基因在动物物种鉴定中具有高拷贝数和序列保守性[21]。通过对多个批次的COI进行测序，确认了这些亚群之间存在44个核苷酸差异。探针和引物设计基于基因组区域内具有物种内保守性和显著物种间差异的区域

讨论

作为重要的动物源药材，GDL因其优异的治疗效果而受到认可，其疗效优于其他种类的地龙[25]。作为GDL配方颗粒的专用来源，它被广泛用于治疗心血管疾病、脑血管疾病和中枢神经系统疾病[26]。近年来，地龙价格的上涨导致了掺假和替代行为的发生，威胁到了公平竞争和患者安全。

此外，A. aspergillum亚群内部也存在差异

CRediT作者贡献声明

段书晨：撰写初稿、方法验证、数据管理。张文娟：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、数据分析。吴哲：数据可视化。程贤龙：资源获取、概念构思。马思宇：资源协调。李萍：撰写、审稿与编辑、项目监督。魏峰：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2023YFC3504104）、国家药品监督管理局药品监管科学体系建设关键项目（NMPAJGKX-2024）和NIFDC关键技术研究基金（GJJS-2022-7-2）的支持。