《Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology》：Molecular clock evidence for an Archean diversification of heme-copper oxygen reductase enzymes
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本研究通过系统发育重建和分子钟分析，发现heme-copper氧还蛋白（HCO）酶在元古宙中期出现，早于大氧化事件（GOE），表明当时局部环境存在足够氧气供好氧生物存活，为地球氧气历史提供了新证据。
Fatima Husain|Haitao Shang|Stilianos Louca|Gregory P. Fournier
麻省理工学院地球、大气与行星科学系，美国马萨诸塞州剑桥市马萨诸塞大道77号55-101室，邮编02139
摘要
基于分子钟分析得出的氧气光合作用出现的时间估计可以追溯到太古宙，远早于大氧化事件（GOE）之后大气持续且不可逆氧化的地球化学证据。关于太古宙生物氧气循环的额外证据将有助于我们了解这一时期的环境氧气浓度和动态变化。本文通过系统发育重建和分子钟分析研究了血红素-铜氧化还原酶，这类酶在许多需氧电子传递链中以氧气作为最终电子受体。分析表明，这些酶很可能在中太古宙时期出现并多样化，这发生在氧气光合作用之前。这些结果与以下观点一致：即在GOE之前，至少在某些环境中已经存在足够的氧气浓度以维持需氧生物的生理活动，从而为理解独立于地球化学记录的行星氧化历史提供了关键线索。
引言
在太古宙期间，生物创新引发了一系列地球化学和生态变化，为复杂生命的出现奠定了基础。最近的分子钟分析表明，能够进行氧气光合作用的蓝细菌早在地球大氧化事件（GOE）之前就已经出现（Boden等人，2021年；Fournier等人，2021年；Sánchez-Baracaldo，2015年），这一转变标志着地球大气的首次显著氧化。氧气光合作用的进化与其地球化学影响之间的时间差异通常归因于太古宙环境中还原性化学物质对分子氧的局部非生物性固定。通过对血红素-铜氧化还原酶（HCO）的系统发育重建和分析，可以评估这样一个假设：即需氧呼吸等生物过程在太古宙期间也消耗了氧气，从而延缓了氧气的积累。
HCO酶是一类多亚基酶，存在于细胞质膜、蓝细菌类囊体膜和线粒体膜中（Calhoun等人，1994年；García-Horsman等人，1994年；Saraste等人，1990年；Saraste等人，1991年）。作为需氧电子传递链中的末端酶，它们通常被称为复合物IV或细胞色素氧化酶，尽管该酶家族中的一些成员使用细胞色素以外的电子供体（Pereira等人，2001年；Sousa等人，2012年）。在线粒体的需氧呼吸过程中，电子从电子供体细胞色素c传递到分子氧，经过酶亚基内的多个电子受体。在此过程中，细胞色素c向铜中心CuA传递四个电子，这些电子随后转移到血红素a，再转移到血红素a3-CuB双核中心，最终被传递给与血红素a3结合的氧分子（Nelson和Cox，2013年；Wikstr?m，1989年）。在此过程中，四个质子从线粒体基质中被用来将氧气转化为水，同时另有四个质子被泵送到膜间隙，从而产生驱动能量储存分子三磷酸腺苷（ATP）合成的质子动力（Nelson和Cox，2013年；Wikstr?m，1989年）。
该过程的一般方程如下：
在该酶家族中，不同成员在具体电子供体、血红素、质子转运通道和分类学分布上可能存在差异（表1）。这些酶的亚基数量也可能不同：原核生物的氧气还原酶可能只有三个亚基，而许多真核生物的氧气还原酶可能有多达十三个亚基（García-Horsman等人，1994年）。尽管存在这些差异，但血红素-铜氧化还原酶家族的成员身份主要取决于催化亚基I的存在，该亚基包含一个低自旋的血红素以及一个由高自旋血红素和CuB铜离子组成的双核中心。亚基I中的六个保守组氨酸残基同时作为血红素和CuB的配体（Sousa等人，2012年）。2001年，Pereira等人根据构成酶核心序列并参与质子转移机制的氨基酸，将氧气还原酶分为A、B和C三类（Pereira等人，2001年）。在这一框架下，A型氧气还原酶进一步分为A1型（类似线粒体的氧气还原酶）和A2型氧气还原酶（Pereira等人，2001年）。对氧气还原酶的生物能量学研究表明，不同亚型的氧气结合亲和力存在差异：A型氧气还原酶的亲和力较低，而B型和C型氧气还原酶的亲和力相对较高（Degli Esposti等人，2019年；Morris和Schmidt，2013年；Trojan等人，2021年）。这些亲和力有时与生物在特定环境中的氧气需求相关，但Sousa等人（2012年）指出，不同的氧气还原酶并不一定局限于特定的生态位。许多原核微生物还使用多种末端氧化酶，包括多种血红素-铜氧化还原酶亚型（Sousa等人，2012年；Trojan等人，2021年）。这种灵活性得益于分支状的呼吸链，使生物能够在不同的氧气浓度下生存（Sousa等人，2012年）。
定义血红素-铜氧化还原酶家族的系统发育边界尚不明确：参与将一氧化氮还原为一氧化二氮的膜结合酶（NORs）的催化亚基在结构上与氧气还原酶相似，但其双核中心不含铜（Hendriks等人，1998年）。HCO酶和NORs亚基之间的相似性促使了许多关于两者潜在进化关系的研究（Chen和Strous，2013年；de Vries和Schr?der，2002年；Ducluzeau等人，2008年；Murali等人，2024年；Saraste和Castresana，1994年；Sharma和Wikstr?m，2014年；van der Oost等人，1994年）。广泛的系统发育重建表明，HCO酶和NORs形成了不同的群体，C型氧气还原酶和NORs关系密切（Ducluzeau等人，2014年；Sousa等人，2012年；Sousa等人，2011年）（图1）。
关于HCO酶的进化有许多假说（Degli Esposti，2020年），据认为它们是单系群（Castresana等人，1994年；Pereira等人，2001年），是祖先原氧化酶或uroxidase的后代（Castresana等人，1994年），不同亚型通过基因复制事件产生（Castresana等人，1994年）。推断HCO酶亚型的深层进化历史取决于系统发育重建中共同祖先的位置。在之前的研究中，这个祖先的位置是通过基于底物利用的手动方法或中点方法确定的（Gribaldo等人，2009年；Saraste和Castresana，1994年），得出了不同的进化历史。在其他研究中，氧气还原酶的出现情景是根据酶的结构和功能以及太古宙时期的底物可用性来提出的（Ducluzeau等人，2014年；Sharma和Wikstr?m，2014年）。基于来自所有生命域的多样化氧气还原酶代表的系统发育进行的分子钟分析，包括可能通过水平基因转移获得HCO酶的原核生物（Brochier-Armanet等人，2009年；Castresana等人，1994年；Degli Esposti，2020年；Gribaldo等人，2009年；Pereira等人，2001年），以及改进的方法学方法可能更好地解析氧气还原酶亚型的进化历史。为了构建HCO酶的一般进化历史，使用了保守的催化亚基作为系统发育标记。所得到的系统发育树经过子采样，以便进行分子钟分析，同时保持了这些酶的代表性多样性和校准的关键节点。此外，还测试了两种树拓扑结构，评估了低亲和力A型氧气还原酶出现的不同情景的影响。分析结果表明，HCO酶在GOE之前就已经出现，并可能作为早期蓝细菌产生的氧气的生物吸收体。
方法
为了生成适合分子钟分析的HCO和NOR蛋白家族的系统发育树，采用了迭代采样方法，以选择能够代表这些酶广泛存在的序列。由于分子钟分析的数据集规模限制，包含数百个分类单元的树在计算上难以使用密集的贝叶斯方法进行评估（Lartillot等人，2015年）。
结果
对两种系统发育结构的分子钟分析主要关注低亲和力A型HCO酶的位置差异，得出了太古宙时期低亲和力氧气还原酶出现的保守估计时间，这一时间早于GOE。A型氧气还原酶的年龄估计与先前报道的蓝细菌出现时间一致（Fournier等人，2021年）。
讨论
本研究探讨了HCO酶的进化历史，这些酶是直接与分子氧相互作用的需要氧呼吸电子传递链的组成部分，从而重建了需氧呼吸的进化历史。对这些蛋白家族的分子钟分析表明，低亲和力A型氧气还原酶出现于中太古宙，而蓝细菌A型氧气还原酶出现于晚太古宙。
CRediT作者贡献声明
Fatima Husain：可视化、方法论、研究、概念化、写作——审稿与编辑、初稿撰写。Haitao Shang：概念化、写作——审稿与编辑。Stilianos Louca：概念化、写作——审稿与编辑。Gregory P. Fournier：监督、项目管理、方法论、研究、资金获取、概念化、写作——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
FH在本研究期间获得了MIT EAPS John H. Carlson奖学金和MIT Hugh Hampton Young纪念奖学金的支持。本研究由2021年Scialog合作创新奖（授予编号为2021-3128的奖项）资助（授予GPF）。
