筛选和设计广谱适配体，以构建双模式适配体传感器，实现对大环内酯类抗生素的高灵敏度检测

《Talanta》：Screening and engineering of broad-spectrum aptamers for construction of a dual-mode aptasensor for highly sensitive detection of macrolide antibiotics

广谱aptamer通过捕获式SELEX技术筛选获得，经分子对接和截短优化形成含G4结构的40-nt aptamer（F1-apt1-40），对5种大环内酯类抗生素的解离常数低至2.62-10.72 nM。基于该aptamer构建了双模式传感器，通过G4/hem insan过氧化物酶样活性抑制实现比色检测（47.2 nM）和SYBR Green I荧光增强（60.6 nM），检测限低且无需化学标记，实际样品验证显示回收率95.46%-100.86%，15分钟完成全流程检测。

　　

刘月|陈欣|黄天宇|张玉婷|王晓丽|周南迪

江南大学生物技术学院及教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，中国无锡214122

摘要

大环内酯类抗生素（MAs）在医药、畜牧业和水产养殖领域被广泛使用。然而，由于过度使用，这些抗生素的残留物对人类健康构成威胁，并导致生态和环境污染。适配体传感器为同时检测这些残留物提供了一种有前景的解决方案。在本研究中，利用Capture-SELEX技术成功筛选出一种对大环内酯类抗生素具有高亲和力的广谱适配体（F1-Apt1）。通过二级结构分析和分子对接，获得了一种包含40个核苷酸的截短G-四链体适配体（F1-apt1-40），其对五种大环内酯类抗生素的解离常数（K_d）介于2.62至10.72 nM之间。随后，以F1-apt1-40作为识别元件，开发出了一种双模式适配体传感器用于检测大环内酯类抗生素。在这种传感配置中，目标分子的结合会引起适配体G4支架的构象变化，这种变化可以通过（i）G4/血红素过氧化物酶样活性的抑制产生的比色信号，以及（ii）SYBR Green I荧光增强来同时检测。这两种读数可以在单一反应系统中进行，无需对适配体进行修饰或使用复杂的仪器设备。该双模式适配体的检测限分别为：比色模式47.2 nM，荧光模式60.6 nM。使用含有大环内酯类抗生素的实际样品进行的评估实验显示，回收率在95.46%至100.86%之间，相对标准偏差在1.60%至6.10%之间。此外，整个检测过程可在室温下15分钟内完成，为多重大环内酯类抗生素的监测提供了一种低成本、稳健且可现场应用的工具。

引言

大环内酯类抗生素（MAs）是一类广谱抗菌剂，它们能与细菌的50S核糖体亚单位结合，从而阻断蛋白质合成并抑制细菌生长。由于其强大的抗菌活性，它们被广泛用于人类医学、畜牧业和水产养殖。然而，大环内酯类抗生素的过度使用导致了耐药菌株的增加，对人类健康和生态安全构成了威胁[1]。目前的大环内酯类抗生素残留检测技术，如高效液相色谱（HPLC）[2]、红外光谱（IR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）[3]，虽然具有出色的灵敏度和定量准确性，但依赖于昂贵的仪器设备、专业技术人员和严格的操作规程，因此不适合现场快速筛查或多残留物分析。因此，建立简单、灵敏且低成本的原场方法是监测食品和环境中的大环内酯类抗生素残留物的关键。

适配体是通过SELEX技术获得的短单链DNA或RNA寡核苷酸，它们能以高亲和力和特异性结合目标分子，起到“化学抗体”的作用。适配体具有优异的化学稳定性、低合成成本、易于修饰以及批次间变化小[4],[5]。尽管对适配体及其筛选优化进行了大量研究，但由于目标分子的多样性和实验条件的差异，SELEX缺乏通用标准[6]，因此出现了多种变体，如氧化石墨烯-SELEX（GO-SELEX）[7]和毛细管电泳（CE）-SELEX[8]。这些策略可以显著提高筛选效率和性能。然而，针对低分子目标分子的适配体筛选仍面临两个主要瓶颈[9]：一方面，目标分子体积小且表面功能基团有限，导致可利用的氢键/π-堆叠位点较少，难以提高亲和力和特异性[10]；另一方面，传统的SELEX需要将目标分子固定在载体上，而化学偶联往往会导致其构象或电荷分布的改变，从而产生“载体偏倚”的假阳性结果[11]。通过在全同溶液中实施“捕获-释放”循环，Capture-SELEX首次克服了小分子目标“难以固定”的难题[12],[13]。此外，这种“多目标在溶液”方法可以在一次SELEX实验中同时针对结构相关的多种小分子，直接产生能够识别整个抗生素家族的广谱适配体，而不仅仅是单一化合物[14],[15]。

最初通过SELEX筛选出的适配体通常长度为60–100个核苷酸，其中只有部分核苷酸直接参与对低分子目标的识别和结合[16]。剩余的序列往往以冗余或不稳定的三级结构存在，这会降低结合效率和特异性[17]。系统性地截短非必需片段可以减少空间阻碍，同时保留关键的结合域，使解离常数（K_d）降低1–2个数量级，显著提高选择性[18]。

基于适配体的传感器在检测小分子时常常面临灵敏度瓶颈，因为低分子分析物结合后产生的物理信号较弱[19]。为了克服这一限制，引入了多种信号放大策略，将单一识别事件转化为多个输出或级联放大[20]。常用的方法包括：（i）在纳米载体上负载大量酶或染料以增强比色或荧光强度[21]；（ii）核酸扩增技术（PCR、RCA、HCR）将单个序列指数级复制[22]；（iii）催化电路，如DNA酶或G-四链体/血红素DNA酶[23]，通过反复切割或氧化底物持续产生可检测信号。其中，DNA酶介导的放大方法特别具有吸引力，因为它无需蛋白质、完全可编程，并且可以通过金属离子或血红素特异性激活。血红素/G-四链体（G4）DNA酶在结合血红素后获得辣根过氧化物酶样的活性，在H₂O₂存在下催化显色底物（如ABTS或TMB）的氧化[24]。将G4模块嵌入适配体探针中，将目标识别和酶促放大结合到一步中，充分利用了基于核酸的传感器的简单性、可编程性和高灵敏度。与常见的单信号传感器相比，双模式适配体结合了两种不同的检测技术和通道，不仅保留了单模式传感器的优点，还通过互补两种信号减少了假阳性信号，提高了抗干扰能力，并进一步提高了检测准确性和灵敏度[25]。荧光和比色检测因其高灵敏度、简单性和快速响应时间而特别具有吸引力[26]。

本文通过Capture-SELEX筛选出了能够识别5种大环内酯类抗生素的广谱DNA适配体。通过分子对接和同源性引导的截短，获得了一种包含40个核苷酸的G-四链体序列（F1-apt1-40），该序列在保持完全目标特异性的同时提高了亲和力。以F1-apt1-40作为识别元件，构建了一种结合SG I荧光检测和G-四链体催化的比色检测的双模式适配体传感器。该适配体的性能通过添加大环内酯类抗生素的牛奶和环境水样进行了验证。

材料与试剂

红霉素、罗红霉素、克拉霉素、米克拉霉素、螺旋霉素、四环素、青霉素G、卡那霉素和氯霉素购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。DNA寡核苷酸由上海桑贡生物技术有限公司合成，相关序列列于表S1中。PCR和电泳试剂由大连TaKaRa生物技术有限公司提供。链霉亲和素包被的磁珠购自PuriMag

通过Capture-SELEX筛选适配体

为了获得具有广谱、高亲和力和特异性的大环内酯类抗生素适配体，本研究采用了多重大环内酯类抗生素并行选择策略，同时使用5种大环内酯类抗生素作为目标分子进行筛选。5种大环内酯类抗生素的结构如图1A所示，它们都含有核心内酯环骨架和糖基取代基。其中，红霉素、克拉霉素和罗红霉素都属于14元环结构，后两者为半合成化合物

结论

总之，经过多轮Capture-SELEX和同源性引导的截短后，获得了一种包含40个核苷酸的G-四链体适配体（F1-apt1-40），它能以低纳摩尔浓度（2–10 nM）识别5种重要的大环内酯类抗生素（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、螺旋霉素和米克拉霉素）。通过对血红素/G4-DNA酶催化和SG I报告系统的系统优化，开发出了一种无需任何化学标记或纳米材料合成的双读数平台。

CRediT作者贡献声明

黄天宇：验证、形式分析。王晓丽：监督。刘月：撰写——初稿、研究、数据管理。陈欣：研究、数据管理。周南迪：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。张玉婷：监督

未引用参考文献

[28]。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：42477491、42177212）的财政支持。