综述：下一代免疫生物传感器：变革食源性病原体检测

《Talanta Open》：Next-Generation Immuno-Biosensors: Transforming Foodborne Pathogen Detection

这篇综述系统阐述了免疫生物传感器（Immuno-biosensors）在食源性病原体检测领域的最新进展。文章重点比较了基于信号转导（如电化学、光学、石英晶体微天平（QCM））和基于平台设计（如侧向流动分析（LFA）、微流控纸基装置（μPAD）、微芯片装置）的两大类传感器，强调了它们在检测限（LOD）、线性范围、检测时间及实际样品应用方面的性能。作者指出，尽管这些技术为现场快速检测（Point-of-Care, POC）提供了高灵敏度、快速且具成本效益的解决方案，但其可重复性、废弃物产生以及对操作人员的依赖仍是未来研究需要克服的挑战。

　　

摘要

食源性病原体持续构成严重威胁，尽管已有安全措施，但仍迫切需要高灵敏度、快速的传感技术来预防疫情爆发并减轻其破坏性的健康和经济影响。传感技术从酶基生物传感器到先进的免疫基方法的演变，体现了在病原体检测灵敏度、速度和可行性方面持续改进的动力。免疫生物传感器通过微型化方面的进步，为传统方法提供了快速、灵敏且经济高效的替代方案，彻底改变了病原体检测领域。本综述将总结免疫生物传感器在食品病原体传感方面的最新进展、其有效性、进展和类别。讨论将从定性走向定量，涵盖已开发的免疫生物传感方法中遇到的挑战和漏洞，包括影响可重复性、废弃物产生和对训练有素操作员依赖性的材料相关问题（例如，纳米材料的批次差异性、一次性纸基材）和检测设计问题（例如，复杂的微流控结构和多步骤方案）。与通常专注于孤立传感机制的既往综述不同，本文对基于信号转导和基于平台设计的免疫生物传感器进行了比较分析，并特别强调了与现场护理食品病原体检测相关的最新进展。

1. 引言

病原体是任何外源因子或微生物，与生物物种接触后可引起各种疾病。这包括各种类型的生物体，如细菌、病毒、真菌和寄生虫，它们通过受污染的食物或饮料侵入人体。这种入侵破坏了正常的生理功能，导致严重疾病或致命感染。历史上，食源性疫情造成了重大的健康和经济损失。尽管实施了某些安全措施，新的病例仍在不断出现，这凸显了对最终传感方案的迫切需求，以提供准确的诊断来预防大规模疫情。

作为控制已报告疫情的一种尝试，已有大量研究发表，一些综述也报道了食源性病原体检测的发展。然而，这些报告大多侧重于单一转导机制（例如，电化学或光学传感器），并且在提供新兴现场护理免疫基平台的全面比较方面有所欠缺。此外，以往的文章通常未基于对实际部署至关重要的LOD、线性范围、真实样品性能和检测时间等指标对最新技术进行详细评估。本综述提供了一个深入的文献调查，侧重于对最先进的免疫生物传感器进行最新的比较评估，同时强调它们在现实世界食品安全和疫情预防方面的进展和局限性。

2. 传感器与生物传感器

传感的核心概念是“识别”，指的是使用称为传感器的设备检测、测量和响应物理、化学或生物刺激的过程。传感器通常由三个关键组件组成：用于与目标刺激相互作用的传感元件（例如，热敏电阻、光电二极管或化学试剂）、用于转换检测到的信号的转换器，以及用于解释数据的信号处理单元。基于传统传感器框架，开发了一种更专业的设备来检测生物事件，这被称为生物传感器。生物传感器是一种分析工具，它将生物识别组件与物理转换器集成在一起，以识别和量化样品中的特定生物分析物。生物识别元件包括当生物受体特异性识别并捕获目标分析物时发生的生物/化学事件。这些生物受体包括酶、抗体（Abs）、ssDNA/RNA探针、适配体、噬菌体等。在技术细节方面，生物传感器包括三个基本组件：生物受体、转换器和信号处理单元。虽然传感器和生物传感器的性能基于一系列决定其效率和适用性的特性，但这些特性包括检测范围、分辨率、传感频率、准确性、尺寸、可靠性以及随时间推移的稳定性（漂移）和成本等实际问题。

3. 生物传感器的历史

大多数传感技术是根据病原体爆发事件的需要而出现，并随后在灵敏度方面进行了改进。第一个传感器于1962年以葡萄糖氧化酶酶传感器的形式开发出来。第一个生物传感器于1967年报道，其中葡萄糖氧化酶被固定在凝胶上以测量体外组织和生物溶液中的葡萄糖浓度。作为一种渐进的传感器方法，这些生物传感器将生物学、化学和电子学汇聚在一起，创建了强大的微型生物信号处理器。当1988年报道用于确定感染者HIV-1前病毒DNA的PCR过程时，它也发挥了关键作用。从1980年到1994年，食物中毒案件的增加导致通过采用PCR检测多种微生物（如单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、产志贺毒素大肠杆菌（verocytotoxigenic E. coli）和沙门氏菌（Salmonella））来创建食物病原体库。然而，PCR方法存在一些局限性，例如PCR抑制剂、复杂的定量方法、极端的温度控制和冗长的程序。这使得传感器技术研究人员将焦点从PCR检测转移，并设计出更可行的技术。

一些值得注意的研究工作逐步推进，标志着传感器的新时代。这些工作包括基于免疫学检测追踪食物和土壤样品中病原体的报告。随后是通过基于危害分析关键控制点（HACCP）的食品质量快速检测方法建立和实施合规标准。而2000年代及以后的一些研究引入了流式细胞术检测和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MADLI-TOF-MS）。然而，这些生物传感器很快失去了人们的兴趣，原因有两个主要挫折：试剂、耗材、操作成本非常高，以及需要高技能人员。作为降低成本的应对措施，引入了检测设计的微型化以降低支出成本，从而促进其在诊断市场中的应用。结合微型化，快速系统将有助于感染的即时报告并帮助防止任何污染的传播。从那时起，生物传感器在选择性、特异性、成本效益和实时现场可重复设计平台方面迅速革新。

4. 免疫生物传感器

基于生物受体或生物识别元件的差异，生物传感器主要可分为两种类型：免疫生物传感器，它依赖于抗原-抗体相互作用进行目标检测；和非免疫生物传感器（将不详细讨论），它不包括抗原-抗体相互作用，而是使用酶、核酸（DNA或RNA）、适配体、分子印迹聚合物（MIPs），甚至整个细胞或组织作为其传感机制。

免疫生物传感器可以简单地称为转换器，它检测当抗体与抗原结合时一系列复杂生物过程中发出的响应。随着时间推移，免疫传感器的改进允许快速分析那些关键的结合事件，而无需额外的试剂或分离/清洗方案，这使得它们比常用的传统方法（如PCR和ELISA）更具优势，后者涉及复杂的步骤并且需要专业人员。

免疫生物传感器可以进一步基于信号转导机制和平台设计进行分类，每种都为检测食源性病原体提供独特的优势。如正文所述，A类包括基于信号的传感，取决于机制，例如电化学、光学或压电，正如使用不同类型的设备时所提供的。在电化学免疫生物传感中，使用电化学转换器来分析含有病原体的分析物溶液与抗体修饰电极之间的电子转移。电极通常用还原氧化石墨烯（RGO）、纳米复合材料（NC）、纳米材料（NMs）、分子印迹聚合物（MIPs）、金属有机框架（MOFs）、碳纳米材料、DNA或适配体进行修饰，以提高免疫反应的灵敏度。这些类型的传感器如果选择了适当的响应机制（如伏安法、电位法、安培法、阻抗法和电导法），可以提供现场可部署的监测以及目标分析物检测的高特异性和灵敏度。

第二类基于信号的传感设备包括解释光学信号的转换器，即测量由抗体-抗原相互作用引起的光强度变化。光学免疫生物传感器可以通过诸如基于荧光的检测（测量荧光强度变化）、表面等离子体共振（SPR）（测量折射率变化）、比色法（观察颜色变化）、发光方法（测量光发射）、光纤系统（检测通过光纤传输的光波动）等机制进行操作。与电化学免疫生物传感器类似，光学免疫生物传感器进一步修饰用于信号处理，使用金或银纳米颗粒（AuNPs, AgNPs）、上转换纳米颗粒（UCNPs）、金属纳米团簇（MNCs）、量子点（QDs）、碳点（CDs）和发光金属有机框架（LMOFs）。

第三类且最不流行的基于信号的免疫生物传感器是石英晶体微天平（QCM）免疫传感器。这种生物传感器使用压电原理来感测附着在晶体表面的化学物质的质量。压电原理包括向压电晶体提供高频电压，产生共振，然后通过频率偏移分析其共振频率。分析物大多负载在压电晶体的表面上，负载后，例如，如果分析物含有细菌，则根据粘附或固定化现象，可能会产生负或正的频率偏移。类似地，生物功能纳米颗粒、磁性微珠或等离子体基聚合物是用于食源性细菌检测的QCM传感器中使用的一些质量放大器示例。

在基于平台设计的B类免疫生物传感器中，侧向流动分析（LFA）成为一种低成本、便携、简单、检测结果快速且易于观察的设备。LFA由四个垫组成：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。通常，结合垫含有与抗体结合的纳米颗粒。当LFA试纸条浸入含有抗原或病原体的样品中时，通过毛细管流动会产生有色的控制线和测试线。除了GNPs之外，还有多种纳米颗粒用于增强LFA传感方案的灵敏度，例如彩色乳胶珠、磁性NPs、酶缀合NPs、碳NPs、二氧化硅NPs、胶体铂NPs、聚多巴胺NPs。

另一类基于平台设计的免疫生物传感器是微流控纸基分析设备（μPAD）。与LFA类似，这些也被认为是低成本、轻量级和一次性技术，但一个显著差异是使用的样品体积比LFA小得多。μPAD可以使用光刻和打印机在纸上设计具有特定微通道图案的检测试剂，这特别允许使用更小的体积并集成多个步骤，使病原体检测更加用户友好。

第三类基于平台设计的免疫生物传感器是便携式微芯片设备。这是纸基生物传感器的升级版本，以避免诸如手动操作（无论是纸张折叠、滑动还是试剂转移步骤）等问题，并且还降低了暴露在空气中时气溶胶污染的风险。该芯片包含尺寸为毫米或微米的微通道。每个狭窄通道将根据反应机制从入口携带特定试剂，并在中央部分混合，在那里监测颜色、压力或光散射变化。检测所需机制后，所有试剂将从出口排出。因此，对于检测系统，设计的仪器将包括三个功能组件中的任何一个，例如光学、电学和加热模块，这些模块被集成到一个便携式紧凑盒子中。与LFA或纸基μPAD不同，微芯片设备可以多次使用，从而降低了总体成本以及分析后的废弃物。如今，基于环介导等温扩增（LAMP）的微芯片设备作为快速检测技术引起了极大兴趣。与PCR技术相比，LAMP是一种等温核酸扩增方法，不需要热循环仪，因为它在整个反应过程中使用单一温度。此外，与PCR相比，LAMP对粗样品的接受度更高。因此，它被证明比PCR更灵敏、更特异、更稳定、更快速。除了LAMP，一些策略通过采用适配体组合方案、探针延长扩增（PLA）、有缺陷的T结介导的链置换扩增（dT-SDA）、等温链置换聚合酶反应（ISDPR）来增强微芯片设备生物传感。此外，新的变体包括使用聚合酶链式反应（PCR）产物以及执行实时PCR，这确保了与传统PCR试剂盒相比的低试剂消耗、成本效益高的产品设计、优异的表面性能和高传热效率。

4.1. 基于信号转导的免疫生物传感器

4.1.1. 电化学免疫生物传感器

Joksovi?等人开发了一种单壁碳纳米管（SWCNT）修饰的金叶电极（GLE），提供了一种低成本、便携式的SPE基电化学免疫传感器。该传感器在缓冲液中实现了10¹- 10⁸CFU/mL的动态范围，LOD为1.6 CFU/mL，在新鲜生菜水溶液中为15 CFU/mL。另一团队使用在MXene和钼酸锌（ZnMoO₄/MXene）复合材料修饰的玻碳电极（GCE）上的生物相容性聚多巴胺（PDA）涂层，避免了耗时的二抗步骤。这种无标记免疫生物传感器在牛奶和熏制海鲜中检测单核细胞增生李斯特菌，LOD为12 CFU/mL，线性范围为10 - 10⁷CFU/mL。Emran等人引入了三维氮、磷、硫掺杂碳纳米片（3D-NPS-doped CNSs）修饰的SPE。3D-NPS-doped CNSs的架构为高负载单克隆抗体（抗金黄色葡萄球菌）提供了多个空位和大的表面积，在30分钟检测时间内产生24 CFU/mL的LOD，线性范围为1.0 × 10²到 1.0 × 10⁶CFU/mL。Zhu等人在由丝网印刷电极和多个反应室组成的微流控芯片上集成了电化学和荧光（FL）双模式检测。该方法在40分钟内同时检测大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）和金黄色葡萄球菌，范围在10到10⁷CFU/mL之间，LOD分别为4 CFU/mL、8 CFU/mL和9 CFU/mL。Yang等人通过将羧基化MXene纳米片（2D C-Ti₃C₂T_x）锚定在二维锌基MOF（2D Zn-MOF）修饰的SPE表面上，开发了一种独特的基于适配体的一步式免疫传感器。该平台通过替换每个目标的适配体，在牛奶和鸡蛋中检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌，LOD分别为6、5和5 CFU/mL，线性范围为10¹–10⁶CFU/mL，保质期为15天。

4.1.2. 光学免疫生物传感器

Guo等人提出了一种简单的核磁共振（NMR）探针，使用生物素化抗体与沙门氏菌anatum-羧甲基葡聚糖-钆离子（SA-CMD-Gd）磁性复合物即时检测沙门氏菌。该传感器在牛奶中1.5小时内检测沙门氏菌，线性范围为7.4 × 10¹- 7.4 × 10⁶CFU/mL，LOD为7.4 × 10³CFU/mL，总检测时间为1.5小时。Anzevino等人通过使用抗体功能化金纳米颗粒（fAuNPs）将检测时间缩短至15分钟，当检测到沙门氏菌时，UV-Vis光谱发生比色变化。该方案在鸡肉样品中实现了10¹–10³CFU/mL的范围，LOD为1 CFU/mL，耗时15分钟。为了降低AuNPs的使用成本并提高鲁棒性，用适配体和3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）修饰了Fe₃O₄@MIL-100(Fe)磁性MOF纳米酶以检测单核细胞增生李斯特菌。该比色法在40分钟内在牛奶和肉制品中检测病原体，动态范围为10²- 10⁷CFU/mL，LOD为14 CFU/mL。类似地，Zhou等人通过使用锰钴（MnCo₂O₄）纳米酶将检测时间缩短至15分钟。该纳米酶与带负电荷的金黄色葡萄球菌噬菌体结合，催化TMB氧化，产生蓝色，并在细菌结合时褪色。这种方法在即食食品中15分钟内的工作浓度范围为10¹–10⁸CFU/mL，LOD为77 CFU/mL。采用类似机制，Li等人使用了适配体功能化的钼基卟啉共价网络（PCN-Mo@Apt），增强了TMB底物的过氧化物酶样催化活性，用于同时检测大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。带有氨基的TMB带正电荷，导致与裸PCN-Mo@Apt产生静电排斥，在乳制品和肉制品中30分钟内产生10¹- 10⁵CFU/mL的线性范围，LOD分别为0.578、0.439和0.643 CFU/mL。

4.1.3. 基于QCM的免疫生物传感器

Beyazit及其团队制造了一种适配体修饰的QCM生物传感器，使用Fe₃O₄@PDA@DA-PEG-Apt磁性纳米颗粒沉积在镀金石英晶体上，用于检测牛奶中的单核细胞增生李斯特菌。该传感器提供了1.0 × 10²和 1.0 × 10⁷CFU/mL的范围，LOD/LOQ为148和448 CFU/mL，检测时间为10分钟。然而，晶体表面修饰需要36小时，这影响了其作为便携式平台的可行性。为了消除便携性顾虑，Forinová等人开发了一种便携式可重复使用的QCM生物传感器，具有抗污染三元聚合物基底和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）固定的抗大肠杆菌抗体。结合定制的微流控通道，它在汉堡、捷克饺子和牛奶中检测大肠杆菌O157:H7，显示出10²- 10⁷CFU/mL的动态范围，LOD为7.5 × 10²CFU/mL，并可重复使用多达60次。一项后续研究增加了一个强大、简单的程序，用于自动、可靠地分析检测数据。该方法能够在20分钟测定时间内准确分类大肠杆菌，提供10⁴–10⁹CFU/mL的检测范围，LOD为8 × 10²CFU/mL。

4.2. 基于平台设计的免疫生物传感器

4.2.1. 侧向流动分析（LFA）

侧向流动免疫色谱分析（LFA）因其快速、操作简单和经济实惠的优点，成为最广泛使用的现场护理检测（POCT）技术。Li及其同事开发了一种多适配体纳米酶基（MA-MN LFA），使用三金属Fe₃O₄@MOF@PtPd纳米酶和基于杂交链式反应的适配体（HCR-multi-Apt）靶向细菌金黄色葡萄球菌。该测定在30分钟内提供了非常低的浓度LOD，为2 CFU/mL，宽线性范围为10¹- 10⁸CFU/mL。另一种快速、简单的用于大肠杆菌O157:H7鉴定的技术包括设计一种免疫色谱测试LAMP（LAMP-ICT）试纸条，它将比色LAMP与AuNP基免疫色谱法相结合。该测定能够在40分钟内现场检测病原菌种类，LOD为5.7 CFU/mL，线性范围为5.7 × 10⁶- 0.57 × 10¹CFU/mL，与经典的1-2小时PCR扩增过程相比显著缩短了检测时间。Shu等人合成了三金属PtMnIr纳米酶（PMI），并引入了一种经济高效的无标记LFA（PMI-free-LFA）来检测鸡肉和蔬菜样品中的鼠伤寒沙门氏菌。比色和催化读数分别产生10⁴CFU/mL和10³CFU/mL的LOD，线性浓度范围高达10⁷CFU/mL，测定时间为20分钟。Yang等人通过由二维二硫化钼（MoS₂）自组装的三维（3D）花状复合物和天然植物多酚“单宁酸”（TA）报道了类似的双响应方案。双模式LFA平台（MoS₂/TA-LFA）传感器为鼠伤寒沙门氏菌产生比色和光热信号，并将检测时间缩短至12分钟。当仅添加3 μg/mL的mAb时，这种3D复合材料在牛奶和橙汁中检测细菌的LOD为10³CFU/mL，并具有良好的线性范围10³- 10⁷CFU/mL。随后，Yin等人升级了基于比色-荧光信号的双检测系统，用于多病原体传感。这种多机制检测系统包括纳米球@聚多巴胺@铂（AIENS@PDA@Pt）纳米结构的层层设计，用于检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，比色LOD分别为2 × 10⁴和 5 × 10⁴CFU/mL，而荧光LOD为500 CFU/mL，鼠伤寒沙门氏菌相应的线性范围为5 × 10³- 2 × 10⁶CFU/mL（比色信号）和500 - 5 × 10⁶CFU/mL（荧光信号），金黄色葡萄球菌为2 × 10⁵- 2 × 10⁷CFU/mL（比色信号）和5 × 10³- 5 × 10⁶CFU/mL（荧光信号）。

4.2.2. μPAD免疫生物传感器

不幸的是，μPADs如今大多用于疾病诊断或食品质量评估。尽管如此，我们将讨论一些与食源性病原体传感领域相关的发现。设计了一种LAMP集成纸基生物芯片，用于同时鉴定大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。该制造设备由一个用于成像的3D打印暗箱组成，该暗箱集成了光学元件、带有温度控制单元的加热板和一个芯片平台。LAMP反应包括钙黄绿素和Mn²⁺荧光指示剂，用于在30分钟测定时间内以10 CFU/mL的LOD检测抗原。此外，整个