《Frontiers in Immunology》：Tumor heterogeneity assessment using single-cell RNA sequencing (scRNA-seq): applications in lung cancer for diagnosis and treatment
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本综述系统阐述了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术在解析肺癌肿瘤异质性、肿瘤微环境（TME）及免疫细胞浸润等方面的前沿应用，重点探讨了其在生物标志物发现、患者分层及靶向治疗中的临床转化潜力，为克服非小细胞肺癌（NSCLC）治疗耐药性提供了新视角。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的迅猛发展为肿瘤异质性研究带来了革命性突破。与传统批量RNA测序（bulk RNA-seq）相比，scRNA-seq能够在单个细胞水平解析转录组，揭示细胞类型、基因表达模式、信号通路以及罕见细胞亚群等关键信息，这些信息在批量测序中往往被掩盖。尤其在肺癌领域，scRNA-seq的应用正深刻改变着我们对疾病生物学本质的理解，并为诊断、预后判断和治疗策略的优化提供了全新工具。
从RNA测序到单细胞RNA测序 - 方法
单细胞和空间RNA测序是当前解析肿瘤分子和细胞特征的重要分析方法。尽管批量RNA测序在过去二十年被广泛用于癌症生物学研究，但其低分辨率数据难以刻画高度异质的肿瘤生物学特性。scRNA-seq则能描绘出更精细的肿瘤异质性图谱，更好地理解肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）中其他细胞（如免疫细胞、基质细胞）之间的相互作用，并协助识别新的治疗靶点。不同的scRNA-seq平台在灵敏度、通量和重现性上各有特点，研究人员需根据样本类型和大小选择合适的平台。
软件和数据分析
scRNA-seq数据的爆炸式增长催生了众多计算分析工具，如Seurat、Scanpy和Bioconductor等。标准的分析流程通常包括：原始数据处理（通过细胞条形码或独特分子标识符UMI将测序读数比对到参考基因组）、质量控制（过滤双联体、低质量细胞和濒死细胞）、数据标准化（消除采样效应和系统变异）、降维可视化（使用PCA、UMAP、t-SNE等方法）、细胞聚类与注释（基于典型标记基因或机器学习方法）。在此基础上，可进行基因层面的探索性分析，如差异表达基因（DEGs）鉴定、基因集富集分析（GSEA），以及细胞层面的分析，如细胞亚群鉴定、轨迹推断（研究动态基因表达变化）、细胞间通讯分析等，这些分析对于理解肿瘤发生、发展和治疗耐药机制至关重要。
scRNA-seq在肺癌中的应用
在肺癌研究中，scRNA-seq技术已被广泛应用于生物标志物发现、肿瘤异质性研究、基于肿瘤内免疫细胞群的患者分层以及靶点和药物发现。
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利用scRNA数据发现肺癌生物标志物
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诊断标志物：针对肺癌患者低应答率和频繁出现的获得性耐药（包括免疫治疗），早期诊断标志物的需求迫切。例如，一项研究基于线粒体自噬相关基因构建的诊断模型，在预测非小细胞肺癌（NSCLC）发生方面显示出高精度（AUC值达0.925和0.966）。研究表明，鉴于肺癌的高度异质性，联合生物标志物比单一标志物更具诊断价值。
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预后标志物：预后标志物用于估计患者未来临床事件的可能性。通过结合scRNA-seq数据和解卷积的批量RNA-seq数据，研究人员发现，肺鳞癌（LUSC）中II型肺泡细胞和基底细胞比例增高，或肺腺癌（LUAD）中成纤维细胞比例增高，预示着患者预后较差。基于自然杀伤（NK）细胞标记、T细胞标记、中性粒细胞胞外诱捕网（NETosis）相关基因或溶质载体（如SLC7A11）等的预后特征模型，均显示出对NSCLC患者生存期的预测能力。
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药物反应预测标志物：预测性生物标志物用于预测患者对特定治疗（如靶向治疗、免疫治疗）的应答可能性。例如，基于NK细胞标记基因特征的风险评分可预测LUAD患者对PD-L1疗法的反应（准确率76.1%）。针对癌症相关成纤维细胞（CAF）相关基因的特征模型，也能区分对PD-L1阻断免疫治疗有不同反应的患者群体。对免疫治疗耐药患者的研究发现，上皮细胞中高表达的ACTN4、ATF3等基因可能与耐药相关。
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利用scRNA-seq表征TME的肿瘤异质性
肿瘤异质性是肿瘤学的主要挑战和耐药性的主要原因。scRNA-seq使得能够在肿瘤组织、癌旁组织和外周血中评估异质性，揭示具有特征性基因表达谱的新细胞群体、细胞间通讯、细胞分化和TME中的基因调控网络。例如，研究发现男性和女性NSCLC患者肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的差异表达基因（如C1QC、FN1、SPP1）可能与预后和免疫治疗获益相关。LUAD和LUSC的免疫微环境（TIME）存在显著差异，例如LUSC中的SPP1+巨噬细胞亚群可能促进肺纤维化。对小细胞肺癌（SCLC）的研究则揭示了其广泛的瘤内异质性、谱系可塑性以及DLL3等靶点表达的动态变化，这可能与靶向治疗耐药有关。
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基于T(I)ME结构的scRNA-seq患者分层
患者分层可以显著提高临床成功的可能性。scRNA-seq研究通过分析TME中的免疫细胞组成和状态来实现这一点。例如，基于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）模式，可将NSCLC患者分为两组：一组富含预耗竭CD8+T细胞、非活化Tregs和活化CD4+细胞，预后较好；另一组富含耗竭T细胞和活化Tregs，预后较差。对接受新辅助免疫联合化疗的NSCLC患者进行分析发现，主要病理缓解（MPR）患者的TME中MHC-II基因高表达，细胞毒性T细胞被激活和招募，而免疫抑制细胞（如Tregs、CCL3+中性粒细胞、SPP1+TAMs）较少。另一项研究根据TME细胞组成将LUAD患者分为“惰性TME”模式（预后较好）和“活化TME”模式（预后较差），这为治疗决策提供了潜在工具。
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利用scRNA-seq进行肺癌药物和靶点发现的最新进展
scRNA-seq有助于靶点识别、临床前模型选择以及药物反应和疾病监测。例如，研究发现NF-κB和IL-6/JAK/STAT3通路可能与EGFR突变肺癌中药物耐受持久细胞的产生和肿瘤复发有关。在LUAD中，识别出与巨噬细胞相关的预后特征基因（如VEGFA、TIMP1、SPP1）或与免疫浸润相关的枢纽基因，为开发新策略提供了可能。在LUSC中，CD36被发现在巨噬细胞分化中起调控作用，其高表达与预后不良相关，并且筛选出能降低CD36表达的小分子化合物（如雌二醇、阿利维A酸等），显示出靶向治疗潜力。
挑战
尽管scRNA-seq前景广阔，但仍面临诸多挑战：样本制备和测序成本高昂；不同平台和数据质量影响结果的可靠性和可重复性；大多数生物标志物模型仍需临床验证；样本质量（如FFPE样本的RNA降解）和处理过程影响数据质量；缺乏蛋白质和表观遗传信息；组织解离导致空间信息丢失，需与空间转录组学结合；对低表达基因的检测受限；罕见恶性肿瘤缺乏完整的参考数据用于细胞注释；纵向研究中配对样本和临床数据不足；数据分析方法的差异可能导致结果不一致。
结论与未来展望
scRNA-seq技术在肺癌等肿瘤的转化研究中展现出巨大潜力，为深入理解疾病机制和开发新的诊疗策略提供了强大工具。未来，通过提高数据透明度和可重复性（共享原始数据、分析代码、使用标准化流程、在不同数据集中验证结论），以及关注患者群体多样性（种族、环境、癌症亚型等）对肿瘤生物学的影响，将推动scRNA-seq研究更加可靠、包容，并最终更好地转化为临床实践，造福患者。
