《Frontiers in Microbiology》：Free-living amoebae and their role in Piscirickettsia salmonis transmission in Chilean Salmon aquaculture: insights from in vitro and in vivo studies
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本研究首次证实自由生活阿米巴（FLA）可作为杀鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）的环境储库与传播载体。通过免疫荧光与定量PCR（qPCR）技术，揭示了P. salmonis能够被卡氏棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）与Vannella sp.内化、复制并释放，并在此过程中上调其Dot/Icm分泌系统基因表达。研究阐明了P. salmonis利用原生动物宿主在海洋环境中持久存留与传播的新机制，为智利鲑鱼养殖业中鲑鱼立克次体败血症（SRS）的防控策略提供了关键科学依据。
自由生活阿米巴及其在智利鲑鱼养殖中杀鲑鱼立克次体传播中的作用：来自体外和体内研究的见解
引言
杀鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）是一种革兰氏阴性兼性细胞内细菌，是鲑鱼立克次体败血症（SRS）的病原体，对全球鲑鱼养殖业构成严重威胁，尤其在智利造成高达52.2%的死亡率及重大经济损失。尽管对其生物学理解有所进展，但其毒力因子、抗菌素耐药基因和基因组变异性仍存在关键知识空白。该病原体在宿主细胞内存活的能力使其难以控制，其持久存留机制和传播动力学尚未完全阐明。新出现的证据表明，P. salmonis在疾病暴发中作用日益突出，亟需了解其在海洋环境中的生命周期、储库和传播途径。
自由生活阿米巴（FLA）是普遍存在的原生动物，能在广泛的极端环境条件下生存，通常在两个不同的生命阶段之间交替：滋养体（trophozoite），一种代谢活跃的营养状态；和包囊（cyst），一种在不利条件下诱导的休眠、抗性形式。阿米巴主要通过吞噬细菌获取营养，细菌被包裹在吞噬溶酶体中并遭受氧化应激、水解酶、酸化、营养限制和抗菌分子的攻击。虽然许多细菌在这些恶劣条件下被降解，但一部分被称为抗阿米巴细菌（ARB）的细菌能够在阿米巴内存活甚至复制。这些细菌可能利用细胞内环境进行保护和持久存留。在“One Health”框架下，FLA是水生生态系统的组成部分，可以作为细菌持久存留和传播的载体。P. salmonis与FLA的相互作用，特别是在鲑鱼生产环境中，仍未得到充分探索。本研究首次提供了实验证据，表明P. salmonis可以在受控条件下在自由生活阿米巴内存活，这一机制类似于嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）在水生环境中持久存留的策略。
材料与方法
研究中使用的Piscirickettsia salmonis为LF-89株（ATCC VR-1361），在补充了0.1% L-半胱氨酸和1%葡萄糖的绵羊血琼脂平板上于23°C培养。Acanthamoeba castellanii（ATCC? 30,234）常规在ATCC? Medium 712 PYG（添加添加剂）中于25°C黑暗无震荡条件下维持。为评估与P. salmonis共培养的潜力，测试了A. castellanii在多种培养基中的生长。SHK-1细胞系（源自大西洋鲑（Salmo salar）头肾白细胞）在18°C下使用补充了15%胎牛血清（FBS）的Leibovitz‘s L-15培养基维持。
为了研究感染动力学，将A. castellanii滋养体与P. salmonis以10的感染复数（MOI）共孵育。通过免疫荧光和qPCR在不同时间点分析感染情况。使用LysoTracker? Red DND-99标记酸性区室，并通过间接免疫荧光染色检测P. salmonis。还进行了实验，用先前感染了P. salmonis的A. castellanii滋养体和包囊攻击SHK-1细胞，监测细胞病变效应（CPE）。
从智利艾森地区患有阿米巴鳃病（AGD）的鲑鱼鳃和粘液样本中分离海洋阿米巴。基于形态学特征和18S rRNA基因测序，将分离的海洋阿米巴鉴定为Vannella sp.。通过常规PCR、qPCR和间接免疫荧光试验（IFAT）检测分离的海洋阿米巴中P. salmonis的存在。随后，在体外用P. salmonis感染Vannella sp.，并评估细菌负载量和基因表达。
最后，进行了一项体内实验，用感染了P. salmonis的Vannella sp.挑战大西洋鲑鱼苗。通过qPCR在指定时间点检测鱼肝脏中P. salmonis的存在和数量。
结果
Piscirickettsia salmonis存留于卡氏棘阿米巴内并表达毒力基因
感染动力学分析显示，在感染后2、24、48和168小时，P. salmonis存在于A. castellanii的消化液泡内。共聚焦显微镜显示，P. salmonis可在A. castellanii的消化和收缩液泡中存留长达7天。受感染的A. castellanii培养物中细菌负载量定量显示，细菌数量从2小时时的约105下降到72小时时的104。对Dot/Icm分泌系统组分编码基因dotB的表达分析显示，在阿米巴感染期间，该基因显著上调，与对照组相比，在感染末期增加了高达102倍。
卡氏棘阿米巴作为杀鲑鱼立克次体的体外载体
用先前感染了P. salmonis的A. castellanii攻击SHK-1细胞的实验表明，在攻击后72小时可观察到典型的P. salmonis引起的CPE，其特征是细胞空泡化和发亮。在攻击的细胞培养上清液中检测到游离细菌，并通过qPCR在SHK-1细胞中检测到细菌。qPCR定量分析证实了这些观察结果。
从鱼鳃中分离海洋阿米巴
成功从智利洛斯 Lagos地区一个经历活动性SRS暴发并表现出鳃阿米巴病临床症状的养殖中心的鲑鱼样本鳃中分离出海洋原生动物。经过传代和清洗后，获得了形态一致、贴壁生长的原生动物培养物。基于形态学和针对18S rRNA基因的PCR分析，将该原生动物鉴定为Vannella属。
Vannella sp.内共生细菌和杀鲑鱼立克次体的检测
在评估Vannella sp.非纯净培养物中的内部细菌时，使用不同抗生素（链霉素、庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素B、环丙沙星）单独或组合使用均未能获得纯净培养物，表明共生细菌对这些抗生素具有抗性。然而，在所有测试浓度（3 μg/mL至30 μg/mL）下，亚胺培南能够消除细胞外培养基中的细菌含量。但在从滋养体去除抗生素48小时后，再次观察到细菌生长，这表明Vannella sp.在消化液泡中窝藏这些细菌。通过16S细菌测序，鉴定出Vannella sp.中主要存在的细菌属于Alcanivorax和Vibrio属。此外，通过免疫荧光在从鱼鳃分离的Vannella sp.内部以及外部培养基中或与阿米巴相关的生物膜/细菌聚集体中检测到P. salmonis。qPCR证实了这些结果，量化了Vannella sp.内的P. salmonis负载量，虽然较低但足以被IFAT和qPCR检测到。
杀鲑鱼立克次体可感染从鱼鳃分离的Vannella sp.
体外感染动力学证明，P. salmonis能够感染并在Vannella sp.内持久存留至少168小时（7天）。然而，在攻击后72小时开始观察到病原体引起的阿米巴细胞裂解，这在A. castellanii中未见，表明P. salmonis可能在Vannella sp.中产生生产性感染。qPCR定量Vannella sp.内P. salmonis单位数量的结果支持了这一发现，细菌数量至少在感染后48小时内增加，达到107，并在72小时下降至105。同样，受感染的Vannella sp.培养物上清液中P. salmonis单位数量在48小时后下降，与内部细菌数量的增加相吻合。对P. salmonis用于在鱼巨噬细胞内复制的IV-B型Dot/Icm分泌系统结构基因的表达评估显示，在感染早期表达较高，与在SHK-1细胞系中观察到的相似。
Vannella sp.作为杀鲑鱼立克次体的体内载体
体内实验结果表明，先前感染了P. salmonis的海洋阿米巴可以作为病原体向大西洋鲑鱼样本传播的载体。对暴露于受感染Vannella sp.的每条鱼的肝脏进行分析，以确定P. salmonis为感染病原。细菌在鱼器官中存留至少31天，组织中细菌数量最高达到106级，在21天时超过对照组。尽管检测到其存在，但在评估期间未观察到感染鱼死亡；仅在提取的肝脏中注意到SRS的典型迹象。
讨论
杀鲑鱼立克次体仍然对智利鲑鱼养殖的可持续性构成重大威胁。这种病原体难以在常规培养基中培养，但可以在富集的无菌条件下传代。然而，P. salmonis在海洋环境中持续存在，并可在鲑鱼和非鲑鱼之间传播。受感染鱼类排出传染性细菌并不能完全解释影响临近收获期网箱的疫情暴发程度，这往往导致重大经济损失。
在这种背景下，已有广泛报道称水生环境中的致病细菌经常与自由生活原生动物（FLA）建立共生关系。这些相互作用使细菌能够发展各种生存策略，包括在FLA内存活和复制。棘阿米巴（Acanthamoeba）与其细菌内共生体之间的共生关系是这些普遍存在的原虫病理生理学的关键因素。实际上，棘阿米巴作为一个进化“熔炉”，培育了一个共生细菌之间遗传交换丰富的环境，这一过程在立克次体目（Rickettsiales）内共生体中尤为明显。这个独特的细胞内领域促进了广泛的横向基因转移（LGT），内共生体通过此机制获得对其在阿米巴宿主内存活和相互作用至关重要的基因，从而增强细菌毒力、适应细胞内生活方式、增加抗生素耐药性和强大的应激反应。因此，FLA可能充当载体或“特洛伊木马”，促进病原体向各种宿主传播，特别是在临近收获期鲑鱼网箱等封闭和应激环境中。
我们的假设是，暴露于环境应激源和海水条件的剧烈变化驱使P. salmonis寻求更稳定的环境以增强其持久存留、复制和传播。最近的实验证据表明，P. salmonis采用复杂的机制和活跃的代谢途径对其适应环境应激至关重要。此外，阿米巴和细菌之间的相互作用范围可以从互利共生到寄生。P. salmonis的遗传复杂性和多功能性可能有利于其操纵这种关系为自己谋利。所分析的两种FLA物种生活在淡水和盐水中，这表明观察到的共生关系也可能涉及鲑鱼早期发育阶段。
总之，我们的结果表明原生动物可以作为P. salmonis的环境储库和潜在载体，增进了对该病原体生命周期的理解，并为制定新的疾病控制策略提供了信息。此外，这些发现暗示FLA可能代表其他与海洋水产养殖相关病原体的稳定储库和传播源。
我们的体内结果支持在受控实验条件下阿米巴介导传播假说的可行性。在阿米巴内检测到P. salmonis，随后成功从受感染鱼类中回收该细菌，证明该细菌在细胞内存留后仍能保持活力和传染性。暴露于Vannella携带的P. salmonis的鱼类没有死亡，这与低剂量或亚临床感染一致，正如阿米巴介导的传播所预期的那样。虽然肝脏中细菌DNA的检测证实了系统性感染，但这些结果证明了存活性而非确认的水平传播。然而，这些结果并未提供在自然海洋条件下水平传播的直接证据。需要通过共居实验、实地调查和流行病学监测进一步验证，以确定阿米巴是P. salmonis的真正载体还是仅仅是短暂的环境宿主。
最后，我们的结果还证明自由生活阿米巴可以内化并维持P. salmonis，这表明这些原生动物可能作为环境储库，有助于病原体在水生系统中的持久存留。在我们的实验中，虽然腹腔注射仅用作阳性对照，但使用阿米巴的浸泡暴露更接近自然环境接触。共居和“特洛伊鱼”攻击对于在未来验证近野外条件下阿米巴介导的传播仍然是有价值的方法。这种生态学视角可能有助于改进未来鲑鱼立克次体败血症的预防策略。
