哈萨克斯坦牛传染性鼻气管炎血清学与分子监测研究（2023-2025）：揭示BoHV-1流行规律与防控前景

《Frontiers in Veterinary Science》：Serological and molecular surveillance of infectious bovine rhinotracheitis in Kazakhstan

【字体：大中小】 时间：2026年01月06日 来源：Frontiers in Veterinary Science 2.9

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　　本综述系统呈现了哈萨克斯坦2023-2025年未接种疫苗牛群中牛疱疹病毒1型（BoHV-1）的监测数据。研究通过ELISA（如IDEXX IBR gE Ab Test）和实时荧光定量PCR（rRT-PCR）等技术，证实该国BoHV-1感染呈地方性流行（血清阳性率高达82.79%），并成功建立经德国弗里德里希-勒夫勒研究所（FLI）验证的国家参考血清盘（>95%符合率），为制定区分感染与疫苗接种动物（DIVA）策略和世界动物卫生组织（WOAH） eradication programs 对齐提供了关键科学依据。

1 引言

牛疱疹病毒1型（BoHV-1）是引起牛传染性鼻气管炎（IBR）和传染性脓疱外阴阴道炎（IPV）的病原体，属于α疱疹病毒亚科水痘病毒属。该病毒可导致牛呼吸道、生殖系统和新生犊牛疾病，造成严重的经济损失。病毒能够建立潜伏感染并在应激条件下重新激活和排毒，这使得 eradication 策略复杂化。近年来流行病学研究强调，多来源畜群中BoHV-1的持续存在，以及动物移动、畜群规模和更新政策是感染引入和维持的主要风险因素。

尽管一些欧洲国家通过检测-扑杀和标记疫苗（DIVA）策略成功实施了 eradication 项目，但在生物安全措施应用不一致的高密度 livestock 系统中，BoHV-1仍然呈地方性流行。世界动物卫生组织（WOAH）陆生动物手册和近期项目评估强调，整合血清学、分子检测和国家参考标准的 harmonized 诊断网络和实验室质量保证框架至关重要。

BoHV-1的诊断复杂性源于其 productive 病毒排毒窗口期窄、潜伏感染普遍以及从田间样本中回收活病毒经常失败。这些生物学限制使得分子和血清学监测成为流行病学监测的互补支柱。最近，新型方法如时间分辨荧光 lateral flow 免疫层析试纸条已显示出与实时荧光定量PCR（rRT-PCR）对BoHV-1检测的高度一致性，为田间应用提供了实用解决方案。对流行毒株遗传多样性的分子洞察——基于全基因组测序和系统发育分析——强调了BoHV-1的持续进化和地理结构。

标记（gE缺失）ELISA对于区分感染动物和 vaccinated 动物仍然不可或缺，构成了DIVA项目的基础。比较疫苗试验已证实了BoHV-1标记疫苗的安全性和免疫原性，包括与呼吸道病原体的组合疫苗以及在 water buffaloes 中的替代宿主研究。这些数据强化了即使在疫苗接种情况下，血清学监测也必须持续进行，需使用 validated 试剂和 harmonized 判读标准。

在哈萨克斯坦，BoHV-1继续广泛传播，多次向WOAH通报，并在商业养殖场和小规模养殖户畜群中均确认了血清阳性。国家数据表明存在长期地方性流行，病毒分离成功率有限，并且缺乏用于实验室间比对的统一QA/QC材料。在2023-2025年科技计划（STP）IRN BR218004/0223“改善哈萨克斯坦生物安全措施：应对危险和特别危险传染病”框架下，进行了一项全面的多年研究，旨在评估哈萨克斯坦所有行政区域田间条件下未接种疫苗牛群中牛传染性鼻气管炎（IBR）的流行病学状况。

本研究的目标是：使用 validated ELISA系统在哈萨克斯坦17个区域进行三年（2023-2025）血清学监测；对配对鼻拭子进行分子（rRT-PCR）监测以检测 active 病毒传播；尝试在Vero细胞培养物上进行病毒分离以评估从田间材料中回收病毒的可行性；在弗里德里希-勒夫勒研究所（FLI，德国）开发并 externally validate 国家参考血清盘（阳性和阴性），确认其与国际参考血清等效，并使其能够用于田间血清学监测的QA/QC目的。本研究整合了血清学、分子学和病毒学方法以及 validated 质量保证材料，提供了哈萨克斯坦BoHV-1流行病学的高分辨率描述。通过与当前国际标准和方法学创新对齐，有助于加强国家监测基础设施，并推进哈萨克斯坦建立与WOAH对齐的IBR控制和 eradication 参考系统的长期目标。

2 材料与方法

2.1 研究设计与采样策略

在2023年至2025年间，在哈萨克斯坦共和国所有17个行政区域进行了全国性的多年牛疱疹病毒1型（BoHV-1）监测项目，涵盖商业和小规模 cattle 畜群。该项目整合了来自国家监测报告的2023年 retrospective 数据，以及通过哈萨克斯坦兽医科学研究所（KazSRVI）进行的主动田间采样和实验室测试产生的2024-2025年原始数据。研究在2023-2025年科技计划（STP）IRN BR218004/0223“改善哈萨克斯坦生物安全措施：应对危险和特别危险传染病”框架下实施。采样设计旨在捕捉广泛的区域和生产类型多样性。采用 convenience sampling，优先选择具有可用流行病学历史和自愿参与的畜群。重要的是，本研究包括的所有动物均未接种过BoHV-1疫苗。鼻拭子与血液样本采集自同一动物，确保了配对的血清学和病毒学评估。所有样本在+4?°C下运输，并在48小时内送至哈萨克斯坦兽医科学研究所（KazSRVI，阿拉木图）病毒学实验室处理。

2.2 血清学检测

使用两种商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行针对BoHV-1抗体的血清学筛查：IDEXX IBR gE Ab Test（IDEXX Laboratories, Liebefeld-Bern, Switzerland）——一种阻断ELISA，靶向gE糖蛋白以区分感染动物和 vaccinated 动物（DIVA原则）；ID Screen? IBR Indirect ELISA（ID. Vet, Grabels, France）——用于广泛检测抗BoHV-1抗体。所有操作均按照制造商说明进行。使用Thermo Scientific Multiskan? FC读板器在450 nm波长下测量血清光密度（OD）。当样本与阴性对照比值（S/N%）或样本与阳性对照比值（S/P%）落在制造商推荐的阈值范围内时，样本被视为阳性。内部质量控制包括对10%的样本进行重复测试，并使用在KazSRVI开发的参考阳性和阴性血清验证结果。

2.3 分子检测（rRT-PCR）

使用实时荧光定量PCR（rRT-PCR）检测鼻拭子中的BoHV-1 DNA进行分子筛查。并行应用两种 validated 检测方法以进行质量比较：VetMAX? IBR/BHV-1 Reagents（Thermo Fisher Scientific, USA）和PCR-RHINOTRACHEITIS-CATTLE FACTOR Bovine herpes virus 1, BoHV-1（Russia）。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen, Germany）按照制造商说明提取核酸。PCR反应在QuantStudio? 5 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）上进行。扩增条件为95?°C 10分钟，随后进行40个循环的95?°C 15秒和60?°C 1分钟。当循环阈值（Ct）≤?38时，样本分类为阳性；38?

2.4 病毒分离尝试

使用Vero细胞（ATCC CCL-81）尝试从rRT-PCR阳性鼻拭子中分离BoHV-1。拭子 supernatant 经3000?×?g离心10分钟澄清，通过0.45 μm syringe filters 过滤，然后接种到25 cm²培养瓶中的 confluent Vero单层细胞上。细胞在37?±?1?°C、5% CO₂条件下培养，观察细胞病变效应（CPE）长达7天。每个样本进行三次连续 blind passages。使用参考BoHV-1毒株（Cooper-1, ATCC VR-864）作为阳性对照。所有田间分离物均未观察到CPE，且所有培养物在第三次传代后仍保持PCR阴性，证实了测试材料中不存在复制性病毒。

2.5 国家参考血清盘的开发与验证

为支持检测方法的 harmonization 和QA/QC，KazSRVI于2024年开发了IBR的阳性和阴性参考血清盘。阳性血清来自经间接和阻断ELISA确认、并经PCR进一步验证的自然感染血清阳性牛。阴性血清采集自确认无BoHV-1的动物，这些动物来自无IBR病史且ELISA结果持续阴性的畜群。所有血清经56?°C热灭活30分钟，按三个滴度组（强阳性、弱阳性和阴性）混合，分装并于-20?°C储存。该血清盘在弗里德里希-勒夫勒研究所（FLI, Germany）针对WOAH认可实验室提供的国际参考血清进行了外部验证。验证确认了其在测试的ELISA平台上具有等效性（诊断符合率>95%）。该血清盘随后在2025年血清学监测中实施，以验证哈萨克斯坦实验室的常规诊断性能。

2.6 统计分析

使用GraphPad Prism v9.5.1（GraphPad Software, USA）和R v4.3.1（R Foundation for Statistical Computing, Austria）分析数据。血清阳性率和PCR阳性率计算采用95%置信区间（CI），使用Wilson方法。使用Pearson卡方检验或Fisher精确检验评估区域间 prevalence 差异。应用Z检验评估监测年份间的年度变异。p值<0.05被认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 三年监测概述（2023-2025）

在2023年至2025年间，对哈萨克斯坦所有17个行政区域的牛传染性鼻气管炎（IBR）进行了全面的血清学和分子监测。该项目包括源自国家监测报告的2023年 retrospective 数据，以及通过KazSRVI进行的主动田间采样和实验室测试获得的2024-2025年原始数据。每年均对代表商业和小规模生产系统的未接种疫苗 cattle 畜群进行采样。

总计，在三年期间从306个流行病学单位和112个地区分析了8590份血清样本和4795份鼻拭子，样本来自1至10岁的牛。该综合数据集允许对抗体流行率、病毒核酸检测以及诊断试剂的实验室验证进行比较评估。

3.2 血清学监测（2023-2025）

使用商业ELISA试剂盒（IDEXX IBR gE Ab Test和ID Screen? IBR Indirect ELISA）检测了2023年收集的3795份血清样本、2024年的2500份和2025年的2295份。结果表明IBR病毒在全国牛群中持续传播。

根据农业部国家监测数据，2023年14个区域的平均年血清阳性率为69.13%，而本研究田间调查估计2024年为80.64%（2016/2500），2025年为82.79%（1662/2295）。这表明从2023年到2025年感染流行率有适度增加，同时在全国范围内保持了持续的高感染水平。观察到的变异很可能是由于区域间管理实践、畜群规模和动物移动模式的差异，而非突发的流行病学变化。

记录了显著的空间异质性。2024年，血清阳性率范围从克孜勒奥尔达州的39.44%到阿特劳州和杰特苏州的100%。类似的模式持续到2025年，南部和西部区域保持高血清阳性率。

两种ELISA系统之间的诊断一致性在所有年份均保持较高水平（κ?=?0.93, 95% CI: 0.90–0.96），证实了分析可靠性。对10%样本的复测产生了相同的定性结果，表明高重现性。

3.3 通过rRT-PCR进行分子检测（2024-2025）

2024年引入实时荧光定量PCR（rRT-PCR）检测鼻拭子中的BoHV-1 DNA。2024年分析了2500份拭子，其中280份检测为阳性（11.2%）。2025年检测了2295份拭子，阳性结果比例仅为10份（约0.43%）。

阳性样本的Ct值范围在23.6至37.8之间（中位数约31.2），与亚临床或潜伏感染状态一致。VetMAX? IBR/BHV-1 Reagents（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）和PCR-RHINOTRACHEITIS-CATTLE FACTOR（Russia）PCR试剂盒均表现出等效性能（r?=?0.98, p?

3.4 病毒分离

使用Vero单层细胞（ATCC CCL-81）对2024-2025年所有rRT-PCR阳性样本进行了病毒分离尝试。在标准培养条件（37?°C, 5% CO₂）下进行了三次连续 blind passages。任何田间样本均未观察到细胞病变效应（CPE），并且所有培养物在第三次传代后仍保持PCR阴性。参考毒株Cooper-1（ATCC VR-864）在48小时内产生特征性CPE，证实了细胞系的敏感性。

未能分离到活病毒很可能反映了低病毒载量或在非排毒阶段采样，这与BoHV-1的潜伏感染动态一致。

3.5 参考血清盘的验证

2024年，KazSRVI开发了包含阳性、弱阳性和阴性血清的国家参考血清盘，以支持ELISA-based IBR诊断的标准化。这些血清盘在弗里德里希-勒夫勒研究所（FLI, Germany）针对WOAH认可的国际参考血清进行了外部验证。验证确认了在多个ELISA平台上具有诊断等效性（>95%符合率）。在2025年田间使用期间，储存6个月后重复样本间的OD变异低于5%，证实了高稳定性。

3.6 趋势与观察总结

三年监测证实了BoHV-1感染在哈萨克斯坦呈地方性流行。从2023年到2025年的过渡期特点是血清阳性率增加，表明病毒在未接种疫苗畜群中活跃传播。

分子检测证实了BoHV-1持续的亚临床传播，而培养物中缺乏活病毒则强调了研究期间潜伏感染占主导地位。国内参考血清盘的验证为全国检测方法 harmonization 和与国际标准对齐迈出了重要一步。

4 讨论

本研究旨在通过结合血清学和分子监测，对哈萨克斯坦17个区域未接种疫苗牛群中牛疱疹病毒1型（BoHV-1）的传播进行三年全国性评估。血清学监测显示了高且持续的暴露水平，血清阳性率在2023年达到69.13%，2024年达到80.64%（2016/2500），2025年达到82.79%（1662/2295）。2023年的数据使用相同的商业ELISA平台产生，确保了方法学可比性。这一趋势——从基线到2024年增加，随后在2025年略有下降——反映了病毒的持续传播和可能的群体免疫饱和。空间异质性显著：阿特劳州和杰特苏州达到100%血清阳性率，而克孜勒奥尔达州最低（39.44%），凸显了区域间管理实践、生物安全和 livestock 移动网络的差异。类似的 geographic heterogeneity 在欧洲控制项目中也有描述，其中畜群规模和购买频率是持续存在的主要风险因素。空间异质性可能反映了畜群密度、生产结构和生物安全能力的区域差异，这得到了哈萨克斯坦和中亚 comparable livestock systems 先前流行病学研究的支持。持续的高流行率直至2025年表明存在根深蒂固的地方性流行，并支持需要针对特定区域的控制策略，而非统一的全国性措施。

2024-2025年的并行分子监测为感染动态提供了补充证据。2024年，11.2%的鼻拭子（280/2500）通过实时荧光定量PCR检测为阳性，Ct值从23.6到37.8（中位数约31.2），与亚临床或再激活阶段的低水平粘膜复制一致。2025年，尽管地理覆盖范围相同，但2295份拭子中仅有10份（约0.43%）为阳性。这种下降可能反映了病毒排毒的偶发性，以及可能存在的采样窗口差异或畜群间 temporal 病毒载量差异，而非检测失败。VetMAX? IBR/BHV-1 Reagents和PCR-RHINOTRACHEITIS-CATTLE FACTOR检测方法之间的优异相关性（r?=?0.98, p?

Convenience sampling 是本研究的一个重要局限性。自愿畜群参与和流行病学记录的可获得性可能导致区域和生产类型覆盖不均，可能影响真实流行率的估计。尽管采样涵盖了所有行政区域以及商业和小规模畜群，但数据可能不能完全代表全国 cattle 种群。

从PCR阳性材料中分离病毒的尝试未能回收到任何田间毒株，尽管在Vero细胞中进行了三次 blind passages 且参考毒株Cooper-1产生了清晰的细胞病变反应，证实了细胞培养 competency。无法获得分离株很可能反映了低病毒滴度或在 active 排毒阶段外采样，这与α疱疹病毒的潜伏感染生物学一致。根据WOAH陆生动物手册，实时荧光定量PCR是IBR诊断和监测的主要方法，而病毒分离在田间条件下 inherently 不敏感。因此，依赖分子工具而非病毒回收是合理的，并且在方法学上与当前全球实践对齐。

这项工作的一个关键产出是在弗里德里希-勒夫勒研究所（FLI, Germany）开发并 externally validate 了国家参考血清盘。证明其在多个ELISA平台上与国际参考血清具有>95%的诊断符合率，这些血清盘显著加强了哈萨克斯坦的诊断QA/QC系统。它们在2025年田间的成功部署支持了可持续的检测方法 harmonization 和实验室间可比性——这是现代监测评估框架中的核心绩效指标。这一成就代表了未来认证和与国际报告标准对齐的重要基础设施里程碑。

本研究的优势包括其广泛的时间和地理范围、使用经过验证且具有 proven 重现性的商业检测方法，以及阴性病毒分离结果的透明报告。总的来说，这些特征提供了中亚地区BoHV-1流行病学最全面的数据集之一。然而，需要承认几个局限性。使用 convenience sampling 和非配对血清/拭子设计限制了个体水平推断，并可能导致观察到的血清学-PCR不一致。不同年份间采样季节和畜群组成的差异可能影响了PCR检出率，而2023年数据集——尽管方法学一致——源自国家监测记录，可能在田间 logistics 上存在细微差别。最后，缺乏全基因组测序限制了对毒株多样性和引入途径的解释，尽管部分gC测序为未来的基因组工作建立了技术可行性。这些局限性凸显了在未来的监测周期中需要 longitudinal 配对采样和 harmonized 方案。

观察到的2025年高血清阳性率与显著较低的PCR阳性率之间的脱钩强调，哈萨克斯坦的BoHV-1感染正在进入一个成熟的地方性流行阶段，以潜伏携带者为主，伴有 sporadic 再激活。因此，未来的监测应 incorporate 哨兵畜群内的系列拭子采样，在区域尺度上应用基于输出的无感染指标，并评估针对高风险区域的DIVA兼容疫苗接种策略。整合全基因组测序将能够追踪传播簇并与全球BoHV-1谱系进行比较，推进分子流行病学和风险建模。总之，本研究为哈萨克斯坦基于证据的BoHV-1控制提供了坚实的诊断和分析基础，促进了 harmonized 监测、区域风险 mapping 以及与WOAH推荐的 eradication 路径的渐进式对齐。

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