《Advanced Science》：CGRP Enhances the Regeneration of Bone Defects by Regulating Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Through Promoting ANGPTL4 Secretion by Bone Blood Vessels
编辑推荐：
本研究揭示了感觉神经肽CGRP（降钙素基因相关肽）通过FAK–AKT–VEGF信号通路促进骨血管生成，并诱导骨血管内皮细胞分泌ANGPTL4（血管生成素样蛋白4），进而驱动骨髓间充质干细胞（BMSC）的成骨分化、抑制成脂分化，最终加速骨缺损修复。该发现为骨质疏松及骨再生障碍的治疗提供了新的靶点和策略。
CGRP在骨质疏松患者中的表达
研究团队首先在临床层面探讨了CGRP与骨质疏松的关联。通过分析不同年龄和骨密度状态受试者的血清样本，发现CGRP水平与年龄呈负相关，与骨密度呈正相关。年轻健康个体血清CGRP水平显著高于老年健康个体，而老年骨质疏松患者体内的CGRP水平又显著低于骨量正常或低骨量的同龄人。对公共基因表达数据库（如GSE7158、GSE35959等）的挖掘进一步验证了这一趋势：在高骨密度人群或非骨质疏松老年患者中，编码CGRP的基因CALCA表达更高。这些结果提示，CGRP可能作为预测骨质疏松和年龄相关骨丢失的潜在生物标志物。
CGRP对内皮细胞促血管生成作用
为了探究CGRP对骨微环境的影响，研究者利用小鼠单细胞RNA测序数据进行分析。结果显示，在高表达Calca（编码CGRP）的样本中，内皮细胞显著富集。体外实验证实了CGRP的直接促血管生成功能：用不同浓度CGRP处理人微血管内皮细胞系HMEC-1后，其在小管形成实验中形成的血管样结构分支点和节段数均显著增加，且在Transwell迁移实验中迁移细胞数也明显增多，呈现剂量依赖性。这表明CGRP能有效促进内皮细胞的血管生成能力。
CGRP通过FAK–AKT–VEGF信号通路支持内皮细胞血管生成
机制探索是本研究的核心。通过单细胞数据通路活性分析发现，在高CGRP组中，PI3K和VEGF信号通路活性显著增强。基因集富集分析也显示PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路被激活。磷酸化蛋白质组学分析鉴定出624个差异磷酸化位点，其中FAK的磷酸化水平在CGRP处理后显著上调。进一步的体外验证实验表明，CGRP处理能时间依赖性和浓度依赖性地诱导HMEC-1细胞中FAK（Tyr397, Tyr576/577, Tyr925）、AKT和ERK的磷酸化水平升高，并上调VEGFA蛋白表达。而使用FAK特异性抑制剂PF-562271则可逆转CGRP引起的上述蛋白磷酸化及VEGFA表达增加。这些结果明确了CGRP通过激活FAK–AKT–VEGF信号轴来促进内皮细胞血管生成。
CGRP基因敲除小鼠表现出骨血管密度和骨量降低
在体实验证实了CGRP的生理功能。与野生型小鼠相比，CGRP基因敲除小鼠股骨中CD31highEmcnhigh的H型内皮细胞数量减少，H型血管密度和VEGFA阳性信号均显著降低。Micro-CT和组织形态学分析显示，CGRP敲除小鼠的骨小梁体积分数、骨小梁数量和厚度均下降，骨小梁分离度增加，表现出骨质疏松表型。同时，Runx2阳性成骨细胞减少而TRAP阳性破骨细胞增多，表明CGRP缺失导致骨形成减弱和骨吸收增强。
CGRP敲除小鼠在骨缺损修复过程中骨血管生成减少且骨再生延迟
为了模拟临床骨损伤修复，研究团队建立了小鼠股骨骨缺损模型。术后一周，与野生型小鼠相比，CGRP敲除小鼠骨再生区域的H型血管生成明显迟缓，伴随而来的骨缺损区新生骨量减少，Runx2表达下调，破骨细胞活性增强。这表明CGRP缺失会损害损伤后的血管生成和骨再生能力。
外源性重组CGRP蛋白治疗可促进骨损伤后骨再生
治疗性实验带来了希望。在野生型骨缺损小鼠模型中，术后通过尾静脉注射重组CGRP蛋白，可显著增加骨再生区域的H型血管密度和VEGFA表达。Micro-CT分析显示，CGRP治疗组小鼠的骨缺损修复更完全，骨小梁微结构参数改善，Runx2阳性细胞增多，破骨细胞数量减少。这证明外源性补充CGRP能够有效促进骨损伤后的血管生成和骨修复。
CGRP调控血管内皮细胞分泌ANGPTL4
研究进一步深入探索CGRP促进骨再生的下游效应分子。对单细胞数据中内皮细胞亚群的再分析发现，一个高表达Angptl4的内皮细胞亚群在高CGRP组中特异性富集。体内外实验验证了CGRP与ANGPTL4的调控关系：CGRP处理能上调HMEC-1细胞中ANGPTL4的mRNA和蛋白水平，并促进其分泌到细胞上清液中。相反，在CGRP敲除小鼠的骨组织中，Angptl4的免疫荧光信号和CD31阳性血管面积均减弱。这表明ANGPTL4是CGRP诱导骨血管内皮细胞分泌的关键因子。
ANGPTL4通过与BMSC成骨分化偶联恢复骨形成
最后，研究阐明了ANGPTL4的功能。细胞互作分析显示，高表达Angptl4的内皮细胞与骨髓间充质干细胞之间存在强烈的信号交流。功能实验表明，用重组ANGPTL4蛋白处理BMSC，可剂量依赖性地上调成骨相关基因（Runx2, Alp, Ocn, Opn, Osterix, Postn）的表达和蛋白水平，同时下调成脂相关基因（Fabp4, Pparg, Lpl, Plin1, Adipoq, Id4）的表达。碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示成骨分化增强，而油红O染色显示脂滴形成减少。在骨缺损小鼠模型中，外源性注射重组ANGPTL4蛋白同样能促进骨再生区域的骨形成。
结论
本研究系统揭示了“神经-血管-骨”轴在骨再生中的关键作用：感觉神经衍生的CGRP通过激活骨血管内皮细胞的FAK–AKT–VEGF通路促进血管生成，并刺激其分泌ANGPTL4；ANGPTL4作为一种旁分泌信号分子，进而驱动BMSC向成骨细胞分化、抑制其向脂肪细胞分化，最终实现血管-成骨偶联，加速骨缺损修复。该机制为开发以CGRP和ANGPTL4为靶点的骨质疏松和骨再生治疗策略提供了坚实的理论基础和实验依据。
