HBx通过miR-19a-3p/BAMBI/TGF-β1轴损害弥漫大B细胞淋巴瘤中CD4+T细胞的抗肿瘤活性

《Clinical and Translational Medicine》：HBx hijacks the miR-19a-3p/BAMBI/TGF-β1 axis to impair the anti-tumour activity of CD4+ T cells in diffuse large B-cell lymphoma

本研究揭示了HBV核心蛋白HBx通过下调miR-19a-3p，激活BAMBI介导的Wnt/β-catenin信号通路，进而促进TGF-β1分泌，最终导致CD4+T细胞功能耗竭的新机制。该发现为理解HBV相关DLBCL（弥漫大B细胞淋巴瘤）预后不良的免疫学基础提供了重要见解，并提示靶向miR-19a-3p或TGF-β信号通路是潜在的治疗策略。

　　

1 引言

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最具侵袭性的亚型之一。乙型肝炎病毒（HBV）感染与DLBCL患者的不良预后密切相关，其特征包括发病年龄早、疾病分期晚、对一线免疫化疗反应不佳以及生存期缩短。研究表明，HBV感染可能通过诱导致癌通路和改变肿瘤微环境（TME）参与DLBCL的发生发展。肿瘤微环境中的细胞间通讯是肿瘤进展的关键驱动因素，然而，HBV感染是否介导DLBCL细胞与免疫细胞之间的相互作用尚不明确，其精确机制和相关关键分子仍然难以捉摸。MicroRNAs（miRNAs）因其可通过合成模拟物或抑制剂进行精确靶向的能力，正成为多功能的治疗剂。本研究旨在揭示HBV感染如何重塑DLBCL的肿瘤微环境，特别是其对CD4⁺T细胞功能的影响及其分子机制。

2 材料与方法

本研究综合利用了生物信息学分析和实验验证。公共数据来自TCGA-DLBC队列和GEO数据库，包括RNA-seq、miRNA-seq和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。分析方法包括单样本基因集富集分析（ssGSEA）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、Cox回归分析和Kaplan-Meier生存分析。实验部分使用了人DLBCL细胞系SUDHL-4、HEK293T细胞和小鼠EL4淋巴瘤细胞。从人外周血单核细胞（PBMCs）中通过磁珠分选纯化CD4⁺T细胞。实验技术涵盖双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR、蛋白质印迹（Western blot）、染色质免疫共沉淀（ChIP）、免疫共沉淀（Co-IP）、流式细胞术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学以及小鼠体内模型。单细胞数据分析包括细胞聚类、拟时序轨迹分析和细胞间配体-受体相互作用网络分析。

3 结果

3.1 CD4⁺T细胞耗竭是HBV⁺DLBCL的独立预后标志物

对TCGA-DLBC队列的免疫细胞富集分析显示，与HBV阴性患者相比，HBV阳性DLBCL患者的肿瘤微环境中多种免疫细胞，包括活化的CD4⁺T细胞、Th2细胞、效应记忆CD8⁺T细胞和嗜酸性粒细胞的富集程度降低。在GSE10846队列中的多变量分析证实，CD4⁺T细胞是DLBCL患者的独立预后因素。疾病进展或死亡的患者其肿瘤组织中CD4⁺T细胞的富集程度显著低于达到完全缓解的患者。较高的国际预后指数（IPI）与DLBCL组织中CD4⁺T细胞丰度减少相关。CD4⁺T细胞富集程度低的患者其3年生存率显著降低。免疫组化证实HBx蛋白在肿瘤细胞中表达，而HBsAg主要位于肿瘤间质区域。在过表达HBx的小鼠模型和HBV阳性DLBCL患者组织中均观察到CD4⁺T细胞富集减少。这些发现强调了肿瘤微环境中CD4⁺T细胞的富集是HBV阳性DLBCL的关键预后决定因素。

3.2 与CD4⁺T细胞富集相关的miR-19a-3p被HBV核心蛋白HBx抑制

为了鉴定与HBV阳性DLBCL中CD4⁺T细胞减少相关的miRNA，研究人员分析了过表达HBx的SUDHL-4细胞的miRNA微阵列数据，鉴定出78个差异表达的miRNA。WGCNA分析识别出一个与CD4⁺T细胞强烈相关的基因模块，该模块包含11个miRNA，其中miR-19a-3p同时具备与CD4⁺T细胞相关和被HBx抑制的双重特征。在TCGA-DLBC队列中，低表达的miR-19a-3p预示着较差的3年生存率。功能注释显示miR-19a-3p相关转录本在T细胞活化通路中显著富集。机制上，HBx过表达同时降低了成熟miR-19a-3p及其前体（pre-miR-19a）的水平。生物信息学预测和实验验证表明，转录因子p53可直接结合到hsa-mir-19a启动子区域并促进其转录。HBx与p53蛋白发生物理相互作用，并削弱了p53在hsa-mir-19a启动子区域的结合，同时降低了该区域的组蛋白H3K27ac乙酰化水平，从而导致miR-19a-3p的表达下调。

3.3 MiR-19a-3p通过增强CD4⁺T细胞的抗肿瘤活性促进HBx表达DLBCL细胞的凋亡

研究发现，HBx或miR-19a-3p过表达本身对SUDHL-4细胞的凋亡或活力没有显著影响。然而，在SUDHL-4细胞与活化CD4⁺T细胞的间接共培养体系中，过表达HBx的DLBCL细胞凋亡率低于对照细胞，而miR-19a-3p的过表达逆转了HBx诱导的这种抗凋亡效应。同时，HBx工程化的SUDHL-4细胞引发了显著的CD4⁺T细胞凋亡，并抑制了其增殖能力以及IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B）的分泌，这些免疫抑制效应均可通过miR-19a-3p重建得到有效逆转。这表明miR-19a-3p是DLBCL中CD4⁺T细胞介导的肿瘤免疫监视不可或缺的调节因子。

3.4 MiR-19a-3p在体内增强CD4⁺T细胞介导的对HBx表达肿瘤的抑制作用

在EL4淋巴瘤小鼠模型中，瘤内注射miR-19a-3p agomir（激动剂）显著抑制了HBx过表达肿瘤的生长，表现为肿瘤体积和重量的减少。HBx过表达显著降低了肿瘤内CD4⁺T细胞的浸润，而miR-19a-3p agomir恢复了其浸润水平。功能上，miR-19a-3p agomir挽救了HBx介导的IFN-γ和颗粒酶B表达的抑制。在SUDHL-4细胞的人源化小鼠异种移植模型中，过继转移人CD4⁺T细胞可抑制肿瘤生长，而HBx过表达削弱了这种抑制作用。miR-19a-3p agomir治疗恢复了CD4⁺T细胞的浸润和效应分子产生，并抑制了HBx过表达异种移植瘤的生长。这些数据证明miR-19a-3p能增强CD4⁺T细胞介导的肿瘤免疫监视，并在同系和人源化淋巴瘤模型中抑制HBx驱动的肿瘤进展。

3.5 BAMBI是miR-19a-3p的靶基因

通过整合基因本体（GO）术语和GSEA分析，发现miR-19a-3p相关基因在经典Wnt信号通路调控中显著富集。将三种算法预测的miR-19a-3p靶基因与Wnt信号通路相关基因取交集，并结合生存分析，最终确定BAMBI是miR-19a-3p的关键下游靶点。双荧光素酶报告实验证实miR-19a-3p可直接靶向BAMBI的3'非翻译区（3'UTR）并抑制其表达。在DLBCL细胞中，miR-19a-3p过表达可逆转HBx诱导的BAMBI上调。与HBV阴性DLBCL组织相比，HBV阳性组织中BAMBI表达升高。TOP/FOP-Flash实验证实HBx和BAMBI共同调节Wnt/β-catenin通路的活性。BAMBI敲低显著降低了HBx过表达SUDHL-4细胞中的β-catenin水平。这些结果表明HBx/miR-19a-3p轴通过靶向BAMBI来调节Wnt/β-catenin信号。

3.6 MiR-19a-3p/BAMBI轴调节CD4⁺T细胞的抗肿瘤活性

功能实验表明，抑制miR-19a-3p可减少共培养体系中SUDHL-4细胞的凋亡，而敲低BAMBI则可减弱这种抗凋亡效应。更重要的是，敲低BAMBI减轻了由miR-19a-3p抑制引起的对CD4⁺T细胞的促凋亡和抗增殖作用，并挽救了IFN-γ和颗粒酶B分泌的抑制。在HBx过表达的SUDHL-4细胞中进行的平行实验重现了这些结果，BAMBI敲低恢复了CD4⁺T细胞的凋亡、增殖和效应分子分泌。BAMBI敲低本身并不改变HBx-SUDHL-4细胞的凋亡或活力，证实所观察到的免疫调节是T细胞依赖性的。这些数据确立了BAMBI是miR-19a-3p调节DLBCL细胞与CD4⁺T细胞相互作用的机制桥梁。

3.7 DLBCL来源的TGF-β1将HBx/miR-19a-3p/BAMBI信号转化为CD4⁺T细胞排斥和免疫逃逸

对DLBCL的单细胞转录组数据进行配体-受体（L-R）对分析，发现BAMBI高表达的恶性B细胞主要通过TGFB1-TGFBR2对与CD4⁺T细胞相互作用。功能上，在CD4⁺T细胞中敲低TGFBR2可增加HBx过表达淋巴瘤细胞的凋亡，同时减少CD4⁺T细胞自身的凋亡并增强其增殖和效应细胞因子分泌。机制上，HBx过表达的SUDHL-4细胞表现出TGF-β1的显著上调，这一效应可被BAMBI敲低或miR-19a-3p过表达所逆转。体内治疗实验显示，使用抗TGF-β抗体可显著抑制HBx过表达肿瘤的生长，并恢复瘤内CD4⁺T细胞浸润及其IFN-γ和颗粒酶B的分泌。相比之下，抗PD-1和抗CTLA-4抗体的联合阻断仅产生 modest 效果，既未恢复CD4⁺T细胞浸润，也未增强效应分子产生。临床数据分析表明，在多个队列中，BAMBI或TGFB1的高表达与DLBCL组织中CD4⁺T细胞富集减少相关，并且与较差的治疗反应和预后相关。这些结果将miR-19a-3p/BAMBI/TGF-β1轴与HBx过表达DLBCL中的CD4⁺T细胞功能障碍联系起来，并为靶向TGF-β的免疫疗法提供了临床前证据。

3.8 BAMBI^highDLBCL通过TGFB1-TGFBR2对重塑CD4⁺T细胞表型

单细胞分析显示，BAMBI和TGFB1在恶性B细胞中共表达。BAMBI^highTGFB1^high的DLBCL细胞中，Wnt信号、蛋白质分泌和TGF-β通路被激活，而IFN-γ反应、炎症和凋亡通路受到抑制。对CD4⁺T细胞的分化轨迹分析发现，TGFBR2的表达主要局限于耗竭谱系的细胞。TGFBR2^high的CD4⁺T细胞表现出活化标志物和细胞毒性标志物表达降低，而耗竭标志物表达升高。将肿瘤内CD4⁺T细胞分为7个亚群后，配体-受体相互作用分析表明，与BAMBI^low的DLBCL细胞相比，BAMBI^high的DLBCL细胞通过TGFB1-TGFBR2对与CD4_effector（效应）、CD4_Treg（调节性）和CD4_Th1亚群具有更强的相互作用。这些结果证明BAMBI^high的DLBCL细胞可能通过增强TME中的TGFB1-TGFBR2信号传导来抑制CD4⁺T效应细胞、调节性T细胞和Th1亚群的抗肿瘤活性。

4 讨论

本研究首次提供了直接证据表明HBV感染减少了DLBCL肿瘤内CD4⁺T细胞的丰度，并且损害了其抗肿瘤功能，这与其不良预后密切相关。研究将miR-19a-3p鉴定为HBx调控的新型miRNA，它通过靶向BAMBI调节CD4⁺T细胞功能。BAMBI作为Wnt/β-catenin信号的放大器，其激活导致TGF-β1的上调，进而通过TGFB1-TGFBR2轴驱动CD4⁺T细胞耗竭。单细胞转录组学进一步揭示了TGFBR2在耗竭CD4⁺T细胞亚群中的特异性表达及其在细胞命运决定中的作用。与PD-1/CTLA-4抑制相比，靶向TGF-β通路在体内模型中显示出更优越的抗肿瘤效果，这为治疗PD-1耐药、特别是生发中心B细胞样（GCB）亚型的HBV阳性DLBCL提供了新的思路。本研究揭示了HBV相关DLBCL免疫逃逸的一种新机制，强调了CD4⁺T细胞功能的重要性，并为开发基于miRNA或TGF-β靶向的治疗策略奠定了理论基础。

5 结论

本研究揭示了HBV感染通过下调miR-19a-3p，激活BAMBI介导的Wnt/β-catenin信号，进而促进TGF-β1分泌，最终损害CD4⁺T细胞抗肿瘤活性的新机制。这项工作阐明了CD4⁺T细胞功能障碍在HBV阳性DLBCL侵袭性中的先前未明确的贡献，为其不良预后提供了机制基础。鉴于miRNAs的可靶向性，这些发现提示恢复miR-19a-3p表达是一种有望破坏免疫抑制信号、改善HBV相关DLBCL临床结局的策略。