《Cell Death & Disease》：EIF4B Ser93 phosphorylation by ERK2 promotes epithelial-mesenchymal transition to drive colorectal cancer metastasis
编辑推荐：
本研究针对结直肠癌(CRC)转移机制不清的难题，通过磷酸化蛋白质组学发现eIF4B Ser93位点磷酸化显著上调。研究人员证实ERK2直接磷酸化eIF4B Ser93，增强其稳定性及翻译活性，进而促进间质标志物翻译，驱动EMT和CRC转移。ERK2抑制剂Vx-11e通过抑制该磷酸化发挥抗肿瘤作用，为CRC治疗提供了新靶点。
在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。尤其在中国，由于人口基数大，其新发病例和死亡病例数均位居世界前列。当疾病进展到晚期，发生转移的CRC患者5年生存率骤降至15%以下，中位生存期不足30个月，因此，深入探究CRC的转移机制具有重大意义。
上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是CRC转移过程中的关键步骤，与患者的不良预后密切相关。EMT使得上皮细胞失去极性，获得间质细胞特性，运动能力和侵袭能力增强。然而，由于EMT通路固有的可塑性和异质性，其在CRC中的精细调控机制仍未完全阐明。另一方面，蛋白质磷酸化修饰的异常与癌症进展息息相关，但其在CRC转移中的具体作用仍有待挖掘。
在这项发表于《Cell Death & Disease》的研究中，温思琪等人旨在揭示驱动CRC转移的新磷酸化调控机制。研究人员通过对临床CRC组织进行基于串联质量标签(Tandem Mass Tag, TMT)的定量磷酸化蛋白质组学分析，发现差异磷酸化蛋白(Differentially Expressed Phosphoproteins, DPPs)的功能主要富集在细胞迁移、粘附和EMT等相关通路。其中，真核翻译起始因子4B(Eukaryotic Initiation Factor 4B, eIF4B)第93位丝氨酸(Ser93)的磷酸化水平增加最为显著。
为了验证这一发现，研究团队成功制备了针对eIF4B Ser93磷酸化(p-eIF4BSer93)的特异性抗体。利用该抗体，他们在CRC组织和细胞系中均证实了eIF4B总蛋白及其Ser93磷酸化水平显著上调。功能实验表明，敲低eIF4B能抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。更重要的是，通过构建eIF4B的磷酸化缺陷突变体(S93A，模拟非磷酸化状态)和磷酸化模拟突变体(S93D，模拟持续磷酸化状态)并在敲低eIF4B的细胞中进行回补表达，研究人员发现eIF4B Ser93的磷酸化对于其促进CRC恶性表型至关重要。
机制研究表明，eIF4B Ser93磷酸化并不影响间质标志物（如Vimentin, Snail等）的mRNA水平，而是通过减少eIF4B蛋白的泛素化降解，增强其稳定性，进而提升其翻译活性，最终促进这些间质标志物mRNA的翻译。此外，生物信息学预测和实验验证共同确定ERK2是直接磷酸化eIF4B Ser93的上游激酶。ERK2抑制剂Vx-11e能够抑制eIF4B Ser93的磷酸化以及间质标志物的翻译，从而抑制CRC细胞的增殖和转移。值得注意的是，Vx-11e对表达磷酸化模拟突变体eIF4B S93D的CRC细胞无效，说明其抗癌效应依赖于对eIF4B Ser93磷酸化的抑制。体内动物实验，包括皮下移植瘤模型、脾脏注射肝转移模型和尾静脉注射肺转移模型，均一致证实了eIF4B Ser93磷酸化在促进CRC生长和转移中的关键作用，以及Vx-11e通过靶向该通路发挥的治疗潜力。
关键技术方法
研究综合利用了TMT标记定量磷酸化蛋白质组学技术筛选CRC组织中的差异磷酸化蛋白；通过定制p-eIF4BSer93特异性抗体进行蛋白质印迹(Western Blotting)和免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)验证；利用慢病毒载体构建基因敲低和突变体回补的稳定细胞系；采用CCK-8、集落形成、Transwell、伤口愈合等实验评估细胞功能；通过蔗糖密度梯度离心分析多聚核糖体结合mRNA以评估翻译效率；利用蛋白质合成测定、环己酰亚胺(CHX)追踪实验和体内泛素化实验探讨eIF4B稳定性与活性调控机制；通过GST Pull-down、体外激酶实验验证ERK2与eIF4B的直接相互作用和磷酸化；并建立裸鼠皮下移植瘤和肝/肺转移模型进行体内功能验证。临床样本来源于广西医科大学附属肿瘤医院。
研究结果
磷酸化蛋白质组学揭示CRC组织中蛋白质磷酸化水平
通过TMT标记的磷酸化蛋白质组学分析，研究人员比较了CRC组织与癌旁正常组织，共鉴定出1280个DPPs上的2099个磷酸化位点。KEGG和GO分析显示这些DPPs显著富集于与细胞迁移和粘附相关的通路，如癌症中的蛋白聚糖、粘着斑、紧密连接等。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)进一步表明磷酸化水平上调的蛋白质与EMT显著相关。在筛选出的21个关键DPPs中，eIF4B Ser93的磷酸化水平增加最为显著。
eIF4B及其Ser93磷酸化在CRC组织和细胞系中水平升高
利用新开发的特异性抗体，研究证实eIF4B Ser93磷酸化水平和eIF4B总蛋白水平在CRC组织以及多种CRC细胞系中，相较于正常组织或正常肠上皮细胞(HIEC)均显著升高。
eIF4B敲低抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭，而eIF4B Ser93磷酸化增强这些能力
功能实验表明，敲低eIF4B显著抑制了HT29 CRC细胞的活力、增殖、迁移和侵袭。回补实验进一步证明，与回补野生型eIF4B(WT)相比，回补磷酸化模拟突变体S93D能增强这些恶性表型，而回补磷酸化缺陷突变体S93A则无法有效回补。
eIF4B Ser93磷酸化通过增强eIF4B蛋白稳定性和翻译活性促进间质标志物的翻译
机制探索发现，eIF4B敲低或S93A突变降低了间质标志物（Vimentin, Snail等）的蛋白水平，但不影响其mRNA水平。多聚核糖体分析和RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation, RIP)证实eIF4B通过结合并促进这些mRNA的翻译来调控其蛋白表达。eIF4B Ser93磷酸化（S93D突变）能减少eIF4B的泛素化，增强其稳定性和翻译活性，从而促进间质标志物的翻译。
eIF4B敲低抑制CRC生长和转移，而eIF4B Ser93磷酸化促进这些过程
体内实验表明，敲低eIF4B能显著抑制皮下移植瘤的生长以及肝、肺转移灶的形成。回补eIF4B S93D突变体则能显著促进肿瘤生长和转移，而S93A突变体作用微弱，证实eIF4B Ser93磷酸化在体内同样至关重要。
ERK2直接结合并磷酸化eIF4B Ser93从而促进间质标志物翻译
生物信息学预测和实验验证（Co-IP, GST Pull-down, 体外激酶实验）表明ERK2能直接结合并磷酸化eIF4B的Ser93位点。ERK2抑制剂Vx-11e处理能降低eIF4B Ser93磷酸化水平及间质标志物的翻译效率，但这种抑制效应在表达eIF4B S93D突变体的细胞中消失。
Vx-11e通过抑制eIF4B Ser93磷酸化来抑制CRC进展
Vx-11e能有效抑制表达eIF4B WT的CRC细胞的增殖、迁移和侵袭，以及体内肿瘤的生长，但对表达eIF4B S93D突变体的细胞无效，证明其药效依赖于对eIF4B Ser93磷酸化的抑制。
结论与意义
本研究系统阐明了ERK2/eIF4B-Ser93磷酸化轴在驱动CRC转移中的新机制。ERK2直接磷酸化eIF4B Ser93，通过减少eIF4B泛素化降解增强其稳定性，进而提升其翻译活性，最终促进EMT关键间质标志物的蛋白合成，推动CRC侵袭转移。该研究不仅揭示了eIF4B Ser93磷酸化作为CRC潜在生物标志物和治疗靶点的重要性，也为ERK2抑制剂Vx-11e的临床应用提供了理论依据，指出其疗效与抑制eIF4B Ser93磷酸化密切相关。这项工作深化了对蛋白质翻译调控在肿瘤转移中作用的理解，为CRC的精准治疗提供了新的思路和策略。
