利用生物层干涉法可以简便地对蛋白质与未修饰的Z-DNA之间的结合动态进行定量评估

《Microchemical Journal》：Facile quantitative evaluation of binding dynamics between protein and unmodified Z-DNA by using bio-layer interferometry

Z-DNA与ZBP1、Z22抗体结合动力学及结构变化研究，构建未修饰Z-DNA饵体Bait-cc，通过生物层干涉法定量分析不同离子强度下Z22抗体对B-Z连接处的高选择性结合（>2个数量级），并首次测定ZBP1与未修饰Z-DNA的亲和常数，CD光谱证实ZBP1结合后结构变化。

　　

林莉|刘梦琴|安冉|梁兴国

山东中医药大学药学研究所，济南 250355，中国

摘要

Z-DNA是一种左旋双链结构，存在于所有生物体内，并通过与某些蛋白质在体内的特异性结合发挥重要的生物学功能。然而，由于难以获得可固定在传感器上的未修饰Z-DNA，对其结合动力学的定量分析一直具有挑战性。在这项研究中，我们利用拓扑约束构建了一种无需对Z-DNA区域进行化学修饰的生物膜干扰诱饵（Bait-cc）。通过生物素-链霉亲和素相互作用，将Bait-cc固定在生物层干涉测量（BLI）的传感器表面，从而测量了相应的结合动力学。这使得我们能够在不同的离子强度下定量评估Z-DNA与Z-DNA结合蛋白（在溶液中）之间的相互作用。有趣的是，我们的研究表明，Z22抗体可能在B-Z连接区或其附近表现出结合偏好，其对初始结合位点的亲和力比对后续结合位点的亲和力高出两个数量级以上。出乎意料的是，一旦形成B-Z连接区和Z-DNA，Z22的结合不再表现出序列偏好。此外，还定量评估了ZBP1与未修饰Z-DNA之间的结合动力学。CD光谱分析表明，ZBP1在与Z-DNA结合时发生了结构变化。这项研究不仅增强了我们对Z-DNA生物学功能的理解，还为开发针对Z-DNA相关疾病的治疗方法提供了理论支持。

引言

最近，在研究Z-DNA（左旋DNA双链）结合蛋白的重要生物学功能方面取得了显著进展，这些蛋白诱导细胞凋亡或焦亡的机制也逐渐被阐明[1,2]。在此背景下，Z-DNA与其特定结合蛋白（如ZBP1和ADAR1）之间相互作用的定量分析已成为研究的重点，这对于阐明它们在体内的功能机制具有重要意义。Z-DNA的发现可以追溯到20世纪70年代末。结构研究表明，由d(CpGpCpGpCpG)组成的双链分子具有独特的之字形构象，其基本单元是5′-d(CpG)-3′/5′-d(CpG)-3′二核苷酸对[3,4]。进一步的研究证实，Z-DNA可以在体内形成，尤其是在转录过程中负超螺旋增强时[5],[6],[7]。目前，实验证据支持Z-DNA通过一些特定的结合蛋白（ZBPs）介导某些生物学功能[8],[9],[10]，并且发现Z-DNA可能参与免疫调节和抗病毒防御等过程[11,12]。然而，Z-DNA参与这些生物学过程的具体分子机制仍有待进一步探索。

由于在正常离子条件下难以将未修饰的Z-DNA稳定地固定在传感器上，因此研究ZBPs与Z-DNA的结合动力学具有挑战性。目前已知的ZBPs主要分为两类：一类是特异性识别Z-DNA的Z22抗体，另一类是含有Zα结合结构域的蛋白质（如人类中的ZBP1和ADAR1）。值得注意的是，Z22抗体最初是从系统性红斑狼疮（SLE）患者中分离出来的[13,14]。进一步的研究表明，SLE患者具有更多的抗DNA抗体（针对B型和Z型）[15]。ZBP1（第一个被发现的ZBP）通过其Zα结构域在细胞质中充当先天免疫DNA传感器，这种免疫功能与其结合Z-DNA/Z-RNA的能力密切相关[16]。因此，深入研究Z22抗体与ZBP1与Z-DNA之间的相互作用机制将有助于我们更好地理解SLE等免疫疾病的发病机制以及ZBP1的生物学功能。

有趣的是，早在1986年，Runkel和Nordheim就将d(CG)₁₁和d(CG)₁₆序列引入质粒，并使用二乙基焦磷酸盐（DEPC）足迹法证明Z22与B-Z连接区的结合强度高于与Z-DNA双链区域的结合强度[4]。然而，长质粒DNA的研究容易受到未知因素的影响，如序列效应、非特异性结合以及固定困难等，这使得无法获得可能因结合Z-DNA双链和B-Z连接区而不同的精确亲和常数。因此，迄今为止Z22与含有Z-DNA的B-Z连接区的结合亲和常数仍然未知。1997年，Herbert团队使用生物电阻抗分析（BIA）技术测得Z22与溴化Z型poly(dC-dG)在PBS缓冲液中的结合亲和常数为9.1 nM[17]。然而，这种修饰后的DNA可能无法准确模拟Z-DNA在体内的特性。关于ZBP1（与Z-DNA结合）的研究表明，其两个Z-DNA结合结构域（Zα和Zβ）不仅可以独立结合Z-DNA，还可以通过捕获Z-DNA来稳定Z构象，从而影响B-DNA和Z-DNA之间的平衡[18,19]。当这两个结构域连接在一起时，这种构象平衡的偏移效应显著增强[20]。ZBP1与Z-DNA的亲和力仅在与Zα_ZBP1结合溴化DNA七聚体d(TCGCGCG)₂的情况下进行了研究，报道的亲和常数为35 ± 9 nM[21]。然而，ZBP1与未修饰Z-DNA的亲和力尚未进行研究。

构建含有B-Z连接区的未修饰Z-DNA并将其固定在生物传感器表面，为研究Z-DNA分子的动态相互作用奠定了关键基础。最近，我们成功使用两种互补的环状单链DNA构建了环状双链DNA（Z-B嵌合体，LR嵌合体），其中同时存在未修饰的Z-DNA和B-Z连接区[22,23]。为了引入用于固定的单链DNA部分，我们将两条环状单链DNA（一条较大，一条较小）进行杂交，其中较大的环状单链DNA包含了较小单链DNA的所有互补序列。在获得的LR嵌合体中多余的单链DNA部分可以与能够固定在生物传感器上的单链DNA杂交，从而构建一个用于测量相应蛋白结合常数的评估系统。在这项研究中，我们实现了在不同离子条件下评估Z22抗体和ZBP1蛋白与未修饰Z-DNA的结合。这项研究为理解Z-DNA在相关疾病中的作用提供了新的视角，并为进一步探索Z-DNA的生物学功能建立了技术平台。

材料

T4 DNA连接酶和Exonuclease I购自Thermo Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡；纯度>95%）。Ultra GelRed（一种可以染色双链DNA和单链DNA的染料；纯度>95%）购自Vazyme（中国南京）。Z-DNA特异性抗体（Z22）购自Absolute Antibody Ltd.（英国牛津），纯度>95%，浓度为1 mg/mL。该抗体储存在含有0.02% Proclin 300的PBS缓冲液中。ZBP1（重组Z-DNA结合蛋白）也已购买。

ZBP与未修饰Z-DNA结合亲和力的评估策略及Bait-cc的制备

根据我们之前的报告，两种互补的环状单链DNA的杂交体被称为LR嵌合体，包含左旋和右旋双链区域[22,23]。当引入APP序列时，它主要呈现左旋构象，表现出典型的Z-DNA构象。基于这些发现，我们实施了图1中所示的实验方法，以系统地量化不同离子环境下的ZBPs-Z-DNA相互作用。

讨论

在这项研究中，我们通过将LR嵌合体与生物素修饰的线性单链DNA结合，成功将未修饰的Z-DNA固定在生物传感器上，从而方便地在体外评估ZBPs的结合动力学。LR嵌合体中的单链环（位于较长的环状单链DNA上）与生物素修饰的单链DNA高效杂交（补充图S2B和S2C）。这种双链的形成防止了多余的单链DNA缠绕在LR嵌合体的双链区域周围，确保了...

结论

总之，构建的包含B-Z连接区和左旋双链的LR嵌合体是一个研究ZBPs与Z-DNA之间动态相互作用的优秀模型系统，首先使用未修饰的Z-DNA在体外确定了结合常数。我们的数据表明，Z22可能优先结合B-Z连接区或其附近区域，这表明Z22可能在体内主要通过识别B-Z连接区来发挥作用。

CRediT作者贡献声明

林莉：撰写——原始草稿，监督，方法学，资金获取，正式分析，数据管理。刘梦琴：撰写——审阅与编辑，监督，数据管理，概念化。安冉：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，数据管理。梁兴国：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，数据管理，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了山东省医药卫生科学技术项目（202302021717，资助给L.L.）；青岛市自然科学基金（24-4-4-zrjj-147-jch，资助给L.X.）；山东中医药大学科学研究基金（KYZK2024Q48，资助给L.L.）；山东数字中医药重点实验室的支持。