综述：类风湿关节炎滑膜组织巨噬细胞异质性

《European Journal of Immunology》：Synovial Tissue Macrophage Heterogeneity in Rheumatoid Arthritis

本综述系统探讨了类风湿关节炎（RA）中滑膜组织巨噬细胞（STM）的异质性，重点阐述了其起源（胚胎来源与造血干细胞来源）、功能多样性（如促炎的SPP1+巨噬细胞与具有免疫调节作用的TREM2+巨噬细胞）、代谢特征（如糖酵解与氧化磷酸化）及其与滑膜成纤维细胞等细胞的相互作用。文章强调了单细胞RNA测序（scRNAseq）等新技术在揭示巨噬细胞亚群及其在RA发病机制、治疗反应和疾病预后的关键作用，为开发靶向巨噬细胞的新型疗法提供了重要见解。

　　

1 引言

巨噬细胞是先天免疫系统的核心组成部分，几乎存在于人体的每一个组织中，是一种极具动态性和可塑性的细胞类型。作为主要的吞噬细胞，巨噬细胞负责清除病原体和细胞碎片。这些细胞最初由梅契尼科夫于1883年在海星幼虫中描述，随后根据其大小进行分类。功能上，这些细胞执行三项重要任务：吞噬作用、抗原呈递和免疫调节。尽管这些先天免疫细胞被认为在调节炎症中至关重要，但巨噬细胞亚群在类风湿关节炎（RA）中的确切性质和功能此前一直定义不清，大多数研究仅限于组织学或滑液分析，并基于CD68阳性（这并非巨噬细胞特异性标志物）进行判断。

巨噬细胞最初被分类为两种不同的表型：促炎性（经典激活）的M1细胞和组织修复性（替代激活）的M2细胞，它们代表了光谱的两个极端。然而，最近的研究表明，M1/M2巨噬细胞的范式未能反映这些细胞在疾病中显著的可塑性和多样性。体内的巨噬细胞受到大量刺激，并能够根据环境线索改变其表型，因此它们的细胞表型通常不符合这种僵化的二元概念。现有证据表明，这一范式应扩展以涵盖广泛的巨噬细胞激活状态。本综述将讨论滑膜关节内巨噬细胞的多样性，包括它们的起源、代谢需求以及这些细胞类型在RA中维持/控制炎症的功能贡献。

1.1 类风湿关节炎中的巨噬细胞

类风湿关节炎（RA）是一种慢性、进行性自身免疫性疾病，以滑膜炎症、增生以及软骨和骨的结构破坏为特征。尽管靶向生物制剂在RA中成功应用，但许多患者的治疗效果仍不理想。虽然存在预测严重、侵蚀性疾病发展的标志物，但预测谁将对特定治疗干预产生反应仍然很困难。在RA中，衬在关节上的滑膜组织存在慢性炎症。滑膜是一种特殊结构，允许关节润滑并促进两块相对骨骼的平稳运动。它分为两个不同的层：内膜/衬里层和内膜下/衬里下层。在健康关节中，衬里层通常只有1-3个细胞厚，由两种细胞类型组成：巨噬细胞和滑膜成纤维细胞。该层下方是相对无细胞的衬里下层，由成纤维细胞、分散的血管、疏松结缔组织和脂肪组织组成。

在RA中，滑膜显著扩张，细胞数量和表型均发生变化。巨噬细胞构成了RA滑膜炎症期间大多数先天免疫细胞，并通过多种机制关键地参与引导和塑造炎症及关节破坏。随着单细胞技术的出现，我们开始扩展对髓系亚群复杂性及其在健康和疾病中可塑性的理解。

激活的巨噬细胞在滑膜中促进炎症，表达高水平的关键RA相关细胞因子。除了产生细胞因子和具有吞噬特性外，巨噬细胞还分泌高水平的基质降解酶并向适应性细胞呈递抗原。因此，巨噬细胞是RA炎症的关键参与者。衬里下层巨噬细胞数量的增加是RA活动性疾病的一个标志，CD68⁺巨噬细胞的数量与疾病活动性、影像学关节破坏的进展、氧化应激以及体内滑膜pO₂水平相关。巨噬细胞在RA发病机制中的重要作用，或许最能通过以下事实得到证明：滑膜衬里下层巨噬细胞是发炎关节中与治疗反应持续相关的细胞类型之一，且这种关联独立于治疗类型，表明它们可能是一种能够区分治疗应答者和无应答者的滑膜生物标志物。研究还表明，与银屑病关节炎和中轴型脊柱关节炎等其他形式的炎症性关节炎相比，RA患者衬里下层巨噬细胞和巨噬细胞衍生细胞因子的频率增加，而抗炎巨噬细胞标志物如CD163的表达更常与脊柱关节炎相关。

传统上，根据自身抗体阳性情况（包括抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）），RA在临床上分为血清阳性和血清阴性。组织学分析关于巨噬细胞在血清阴性和血清阳性患者中的作用得出了相互矛盾的结果，一些研究表明ACPA阳性RA中CD68⁺巨噬细胞频率显著增加，并且与ACPA滴度显著相关，而其他研究则显示没有差异。有趣的是，最近一项研究对ACPA阴性和ACPA阳性RA患者的髓系特征进行了单细胞RNA测序（scRNAseq），结果显示ACPA阴性和阳性患者之间存在差异性的髓系细胞组成。在ACPA阴性患者中观察到经典单核细胞的富集，而非经典单核细胞在ACPA阳性RA中显著增加。尽管巨噬细胞在ACPA阳性RA中普遍显著增加，但某些巨噬细胞亚群（如C1QChigh和MARCOhigh）在ACPA阴性患者中富集，而其他亚群（如APOEhigh和FN1high）则优先在ACPA阳性RA中富集，这表明巨噬细胞的作用因血清状态而异。事实上，ACPA在体外也能使巨噬细胞向促炎表型倾斜。更近期的一项研究检查了早期、未经治疗的患者的滑膜，确定了与三种不同病理类型相关的滑膜转录特征：成纤维细胞为主、免疫细胞稀少的病理类型；巨噬细胞丰富、弥漫性髓系病理类型；以及淋巴-髓系病理类型。重要的是，这项研究表明，具有髓系病理类型的患者，其疾病活动度（通过疾病活动评分DAS28-ESR衡量）更高。

免疫组织学分析表明，成熟的常驻巨噬细胞在滑膜内膜衬里层中含量丰富，而滑膜衬里下层则拥有更多异质性的巨噬细胞群体，提示RA滑膜组织巨噬细胞存在空间分布模式。除了所有巨噬细胞共有的吞噬细胞相关的免疫哨兵和清除功能外，现在很清楚巨噬细胞也强烈适应其定居的组织。研究表明，单个常驻巨噬细胞亚群根据其高度特化的功能和位置具有独特的转录和表观遗传特征，表明巨噬细胞本身既能塑造其局部环境，也能被环境所塑造。其结果取决于许多因素，包括定居的组织、巨噬细胞的起源、代谢状态以及局部细胞间通讯。

1.2 滑膜组织巨噬细胞的起源

历史上，主流观点认为巨噬细胞完全来源于造血干细胞（HSC）。然而，一系列复杂的谱系追踪研究极大地挑战了我们对巨噬细胞起源的理解，证明巨噬细胞也可以常驻于组织内，并起源于出生前的胚胎前体。它们的谱系独立于造血过程，并在成年后自我维持。现在认识到，在胚胎发育过程中，三个不同的巨噬细胞前体以独立的波次产生。来自原始造血的第一波卵黄囊巨噬细胞最早在胚胎第9.0天就定居到组织中。第二波定居到胎肝，最终造血在第11.0天建立。第三波来源于造血干细胞（HSCs）定植于骨髓，产生骨髓单核细胞，随后在生命过程中定居于血液。现在理解，组织中可以混合存在胚胎来源和HSC来源的巨噬细胞，它们在这些组织中支持不同的功能。

有趣的是，有证据表明，在建立成熟巨噬细胞池方面，浸润性（HSC来源）与胚胎来源巨噬细胞的相对贡献因组织而异。例如，早期的命运图谱研究表明，大脑中的小胶质细胞主要起源于胚胎发育期间的卵黄囊，而表皮的朗格汉斯细胞则起源于卵黄囊和胎肝。事实上，只有少数组织中的循环单核细胞有助于稳态维持，包括肠固有层和真皮。这种对巨噬细胞起源的新认识引出了一个疑问：HSC来源的巨噬细胞是否能完全复制胚胎来源巨噬细胞的表型和功能？一项研究表明，当成体单核细胞、卵黄囊巨噬细胞和胎肝巨噬细胞被转移到Csf2rb缺陷小鼠的空肺泡生态位中时，这些细胞几乎无法区分地分化为肺泡巨噬细胞。这表明局部巨噬细胞的分化是由组织特异性信号决定的，组织印记是塑造巨噬细胞表型和功能的主导因素。迄今为止，滑膜组织巨噬细胞的起源如何影响其功能身份仍不清楚。此外，人类滑膜中特定髓系亚群的确切起源尚未完全阐明，因为在人类研究中尚未能清晰区分胚胎来源和HSC来源的巨噬细胞。重要的是，界定RA滑膜组织巨噬细胞的确切起源可能为优先操纵特定来源的巨噬细胞提供机会。例如，可以特异性靶向炎性浸润巨噬细胞，而对胚胎来源巨噬细胞的影响最小。未来研究胚胎来源与HSC来源巨噬细胞对健康和疾病状态下关节功能的相对贡献，并对此系统进行操纵，将至关重要。

1.3 滑膜组织巨噬细胞塑造炎症

高通量技术的发展，如单细胞RNA测序（scRNAseq）、质谱分析和空间转录组分析，为髓系异质性提供了前所未有的见解，并极大地扩展了我们对髓系亚群及其在健康和疾病中相对贡献的认识。现在存在多个表征RA和健康滑膜中人类滑膜组织巨噬细胞的scRNAseq数据集。这使得我们能够跨数据集比较髓系亚群，以识别共同和独特的特征，从而充分理解滑膜内存在的众多巨噬细胞亚群，并检验它们对疾病的贡献以及支持其独特功能的内在机制。

尽管不同捐赠者的滑膜组织存在异质性，但可以观察到髓系簇的对应关系，表明滑膜组织髓系群体存在保守的、疾病特异性的作用。例如，TREM2high巨噬细胞在健康滑膜中占主导地位。TREM2high群体以富含APOE（一种脂质结合蛋白）为特征。最近研究表明，TREM2⁺巨噬细胞通过APOE将胆固醇转移到过量的脂滴中，从而发挥免疫调节特性，并促进吞噬作用，同时拮抗髓系对炎症刺激的反应性。因此，RA中TREM2⁺巨噬细胞簇的缺乏及其后续免疫调节作用的丧失可能导致髓系激活不受控制。相反，IL-1B⁺CCL20⁺和SPP1⁺MT2A⁺巨噬细胞在RA滑膜组织中含量丰富，但在健康滑膜中稀少。SPP1⁺巨噬细胞的标志是SPP1（骨桥蛋白）基因表达增强，这是一种在骨重塑中起关键作用的细胞外基质糖蛋白，也被认为是一种炎性细胞因子。临床上，与健康对照患者相比，在RA患者的血清中检测到高水平的可溶性SPP1，且其水平与临床严重程度和疾病复发相关。

研究还表明，RA滑膜组织巨噬细胞的功能影响滑膜内的其他细胞。例如，从健康滑膜组织分离的滑膜成纤维细胞在CD206⁺CD163⁺RA滑膜组织巨噬细胞的条件培养基存在下，会转变为促炎、侵袭性的表型。RA滑膜中的HBEGF⁺巨噬细胞也能够促进滑膜成纤维细胞的侵袭性，而滑膜成纤维细胞反过来能够将HBEGF⁺炎性巨噬细胞塑造为更具炎症性的表型，具有独特的转录调节因子、细胞表面标志物、代谢途径和染色质修饰。成纤维细胞产物（如前列腺素）与慢性炎症信号（如TNF）结合，使巨噬细胞向HBEGF表型倾斜，这表明这两种常驻滑膜细胞之间复杂的相互作用塑造了两种细胞类型，并有助于关节破坏。

相反，特定的滑膜组织巨噬细胞实际上也可能起到保护关节的作用。Alivernini等人描述了发炎滑膜内的MerTK⁺CD206⁺巨噬细胞能够通过分泌解决炎症的脂质介质诱导成纤维细胞的修复反应。后续研究也暗示MerTK是RA发病机制的调节因子。最近一项研究表明，MerTK和另一个TAM酪氨酸激酶Axl调节滑膜炎症，并且它们的滑膜表达受IL-6抑制的调节。MerTK⁺LYVE1⁺MRC1巨噬细胞也被证明在冻结肩囊组织中富含炎症的负调节因子，这是一种以纤维化为主的临床病症。这项研究提示MerTK⁺巨噬细胞可能通过与基质相关成纤维细胞的相互作用在冻结肩的消退中发挥作用。因此，治疗性增强MerTK⁺巨噬细胞可能是解决如RA等持续性炎症病理的一个有吸引力的方法。

此外，最近一项研究根据滑膜组织巨噬细胞表达趋化因子受体CX3CR1（通常参与免疫细胞迁移和细胞-细胞粘附）对其进行表征。研究表明，CX3CR1⁺巨噬细胞居住在滑膜衬里层，并形成一个不寻常的保护性屏障样层，以保护关节免受关节炎相关的炎症。作者证明这些屏障巨噬细胞并非来源于血液单核细胞，而是胚胎来源的，它们通过形成紧密连接的保护性屏障来限制炎症反应，保护滑膜组织。检查人类滑膜组织巨噬细胞的研究也表明，与健康和骨关节炎滑膜组织相比，RA滑膜组织活检中CX3CR1表达降低。类似地，另一项检查RA患者滑膜组织的最新研究确定了LYVE1⁺CD206⁺巨噬细胞是滑膜稳态的关键组成部分。这些细胞在活动性RA期间耗竭，但在治疗反应后恢复，并且发现它们与成纤维细胞和血管细胞一起位于血管周围生态位中，表明它们可能与这些细胞类型相互作用。

因此，这些单细胞分析强调，仅仅依赖CD68等单一标志物来识别或表征特定的巨噬细胞群体，只能为了解其激活状态提供一个窗口，而“巨噬细胞”一词是一个涵盖高度异质性细胞群体的总称。重要的是要考虑多种标志物的组合，以全面定义健康和疾病状态下滑膜内巨噬细胞亚群的多样性。

1.4 滑膜微环境塑造滑膜巨噬细胞

滑膜组织巨噬细胞依赖于其局部微环境或“组织生态位”的信号，包括局部可溶性因子（如趋化因子/生长因子），来执行和指导其多样化和独特的功能。我们最近的研究表明，RA关节的炎症微环境作为一种“按需”信号，将CD206⁺CD163⁺组织巨噬细胞从稳态状态转变为功能失调的、激活的状态，其特征是CD40基因表达升高。CD40是一个重要的共刺激激活标志物，通过CD40/CD40配体途径在RA的致病机制中发挥作用。事实上，CD40等位基因与发生RA的风险相关，并且也已显示CD40配体表达与RA疾病进展相关。CD40-high巨噬细胞也与疾病的临床参数相关，能够自发分泌促炎介质并激活滑膜成纤维细胞，而且重要的是，它们在RA疾病发病早期就被激活。这些发现与先前的研究一致，表明RA中发炎的滑膜微环境可以塑造单核细胞来源巨噬细胞的表型和功能。此外，SLAMF7受体已被确定为RA中超活化巨噬细胞状态的关键相关受体。SLAMF7由炎症部位的巨噬细胞选择性表达，并受IFN-γ的强烈调节。这些研究进一步强化了巨噬细胞具有高度可塑性并适应其微环境需求的概念。

因此，滑膜组织巨噬细胞受到组织稳态丧失（如慢性炎症发生时）的强烈影响。然而，一旦炎症得到控制或消退，例如患者经治疗达到缓解时，结果会如何？滑膜组织巨噬细胞是否会恢复到稳态？Alivernini等人证明，在缓解期，独特的髓系亚群会重新出现，并带有富含炎症负调节因子的独特转录组特征。慢性炎症消退后，滑膜组织巨噬细胞的组成和功能可能会发生永久性改变。在其他疾病背景下，也观察到了这种炎症后的变化。最近一项研究表明，即使炎症消退后，脂肪组织巨噬细胞也获得了更促炎的表型。在RA疾病复发的背景下，确定多次炎症事件对滑膜组织巨噬细胞组成和功能的影响，以及进而对复发发生率的直接影响，将非常重要。

因此，浮现出的图景是巨噬细胞存在于组织内不同的“生态位”中，这些生态位控制着该组织内髓系群体的大小，并将组织特异性身份印记给巨噬细胞，而不论其细胞起源如何。一项研究使用了一种称为HUPO小鼠的新型RA小鼠模型，其中在CD11c启动子控制下删除了Flice样抑制蛋白（Flip，对于防止巨噬细胞FasL介导的凋亡至关重要）。这项研究表明，组织巨噬细胞的减少先于关节炎的发展，其机制是通过开放一个生态位，允许具有分化成组织驻留巨噬细胞能力受损的HSC来源的活化单核细胞流入。这表明滑膜组织巨噬细胞生态位的破坏在从临床前RA向临床RA转变以及疾病进展中起着关键作用。有趣的是，脾脏中的网状成纤维细胞被认为负责定义一个维持和补充脾脏红髓巨噬细胞（RPM）的“生态位”。最近一项研究表明，RPM嵌入一个表达CSF-1的红髓成纤维细胞网状结构中，这些成纤维细胞控制RPM的稳态，并可以参与招募单核细胞来补充耗竭的RPM生态位。这一概念尚未在人类滑膜关节中得到正式研究；然而，可以推测常驻滑膜成纤维细胞可能有助于塑造巨噬细胞生态位。利用空间转录组分析揭示滑膜组织巨噬细胞的原位位置和区域，对于我们理解巨噬细胞生态位以及识别具有强临床相关性的髓系表型至关重要。

1.5 临床前RA中的滑膜组织巨噬细胞

从健康到耐受性破坏和自身抗体产生，再到确立性关节炎的RA发病机制中，免疫功能障碍的机制和转变过程尚不清楚。这仍然是一个备受关注的领域。现在认识到，自身抗体的产生可能先于RA的临床发病数年。事实上，有发生RA风险的个体（IAR）甚至在炎症发生之前就表现出系统性骨丢失。有趣的是，检查RA患者临床未受累膝关节滑膜的研究表明，衬里下层巨噬细胞浸润和巨噬细胞衍生细胞因子的表达。此外，即使在缺乏炎症临床症状的情况下，早期RA中也能发现侵蚀性病变。一项检查ACPA阳性关节痛患者的研究表明，巨噬细胞活性与2年后关节炎的发展相关。这种RA发病前髓系细胞的“启动”在外周血中也显而易见，因为有发生RA风险的个体的循环单核细胞表现出与确立性RA单核细胞类似的超炎症和超代谢表型特征，因此为促炎功能进行了预编程。

我们最近的研究表明，RA髓系细胞的标志性特征在处于发生确立性疾病风险中的个体中已经存在。表达CD40的CD206⁺CD163⁺巨噬细胞存在于有发生RA风险的个体的滑膜中，且早于疾病的临床体征或症状。此外，当在两个先前发表的早期RA数据集中检查时，富含CD40的IL-1B⁺CCL20⁺和SPP1⁺MT2A⁺髓系特征在疾病早期也存在。因此，在三个独立的患者队列中，CD40⁺巨噬细胞特征是RA免疫失调的早期标志。这一点，加上滑膜关节中衬里下层巨噬细胞数量增加被视为活动性疾病的标志，表明某些巨噬细胞亚群可能是RA疾病发病机制的启动因子。表征这些早期的“启动者”对于预防慢性炎症和下游关节破坏至关重要。此外，这些研究强调了研究有RA风险的个体以深入了解RA疾病发病机制演变的重要性。未来比较疾病进展者与非进展者髓系亚群的研究，对于识别疾病进展的生物标志物也将非常重要。

1.6 滑膜组织巨噬细胞的代谢

越来越多的证据表明，细胞代谢决定免疫细胞功能。我们和其他人已经证明，糖酵解通量的增强以及伴随的三羧酸（TCA）循环受损与驱动特定巨噬细胞亚群的致病功能相关。乳酸、谷氨酰胺、琥珀酸和衣康酸等代谢中间产物在RA关节中积累，这些物质随后可以激活滑膜细胞，从而进一步加剧疾病。我们当前的许多治疗策略确实改变了RA中免疫和基质细胞的代谢谱。最近一项研究表明，糖皮质激素能够重编程LPS处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞的线粒体代谢，从而抑制其炎症反应。

事实上，RA中的CD68⁺滑膜巨噬细胞与代谢活性、线粒体功能障碍和氧化应激密切相关，并与体内滑膜pO₂水平负相关。因此，问题在于滑膜组织巨噬细胞在多大程度上具有代谢可塑性？研究表明，来自腹膜终末分化的巨噬细胞表现出一定程度的可塑性，能够响应其微环境进行表观遗传和转录重编程。考虑到代谢重编程、表观遗传学和转录调控在巨噬细胞激活中的相互作用，可以推测滑膜组织巨噬细胞表现出一定程度的代谢灵活性。

然而，关于滑膜组织巨噬细胞代谢需求的数据很少。我们最近的研究实时评估了CD206⁺CD163⁺RA滑膜组织巨噬细胞的生物能量状态，揭示了这些居住于发炎RA滑膜中的巨噬细胞主要依赖氧化磷酸化作为其主要能量来源。一般认为，浸润的炎性巨噬细胞是短命的、终末分化的细胞，依赖糖酵解进行快速免疫激活。相比之下，这种短期的糖酵解代谢可能不支持组织驻留巨噬细胞的体内功能和自我更新能力。组织驻留巨噬细胞很可能需要一个生物能量上“健康”的代谢谱，这或许可以解释RA滑膜组织CD206⁺CD163⁺巨噬细胞尽管处于炎症状态，仍依赖氧化磷酸化的原因。

尽管不同滑膜组织髓系亚群的代谢需求尚未正式研究，但我们推测不同的巨噬细胞激活状态表现出不同的代谢依赖。事实上，我们最近的研究表明，TREM2⁺滑膜组织巨噬细胞簇显示出增强的氧化磷酸化基因模块，尤其是那些居住在健康滑膜中的簇。相比之下，SPP1⁺MT2A⁺巨噬细胞簇与所有其他滑膜组织巨噬细胞簇相比，显示出与糖酵解相关的基因模块表达最高。这与Alivernini等人的数据一致，表明MerTKpos滑膜组织巨噬细胞，包括TREM2pos和FOLR2high亚群，表现出增加的氧化磷酸化途径，而MerTKneg滑膜组织巨噬细胞，包括S100A12⁺和SPP1⁺亚群，表现出高水平的糖酵解酶、整合素和其他肌动蛋白细胞骨架蛋白，提示其具有激活和迁移表型。需要进一步的工作来完全阐明不同滑膜组织巨噬细胞亚群的代谢需求；然而，它们很可能是代谢可塑的细胞。识别支撑特定巨噬细胞功能的代谢途径可能为靶向代谢过程的新疗法提供新途径。

2 结论/未来展望

在过去的十年中，主要得益于复杂的转录组分析技术的出现，关于髓系细胞多样性的知识财富大大增加。我们现在认识到，巨噬细胞可以根据其起源、定居组织、与其他细胞的相互作用、细胞微环境和代谢状态执行多种多样的功能。揭示RA中髓系细胞的更多信息应有助于改善患者护理的新方法。鉴于一些巨噬细胞来源于循环单核细胞，它们可能作为滑膜内细胞的重要血液相关性指标，从而提供关键的血液生物标志物。与RA特定病理类型相关的髓系亚群可能在基线时预测治疗反应，并提供追踪疾病复发的方法。最后，识别