《MicrobiologyOpen》：Hidden Partners in Diversity: Acidobacteriota and Their Distribution in the Cape Floristic Region
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本文首次采用牛津纳米孔技术对开普植物区系（CFR）两个自然保护区（Jonkershoek和Kogelberg）的26份土壤样本进行16S rRNA全长测序，揭示了酸杆菌门（Acidobacteriota）在贫营养fynbos生态系统中的群落结构特征。研究发现该门菌相对丰度达1.5%-36.25%，其中 subdivision 1（SD1）为优势类群（Kogelberg:66.96%±8.96%，Jonkershoek:30.35%±0.15），并首次报道SD17和SD22在fynbos土壤中的存在。通过非度量多维尺度分析（NMDS）和Spearman相关性研究，证实土壤pH值、电导率（EC）、碱性磷酸酶等环境因子驱动群落分化（p=0.001），为解析寡营养环境中微生物适应性进化提供了新视角。
图形摘要
本研究通过纳米孔测序技术揭示南非开普植物区系（Cape Floristic Region, CFR）营养贫乏fynbos土壤中酸杆菌门（Acidobacteriota）的多样性分布规律。对Jonkershoek和Kogelberg两个自然保护区的26份土壤样本进行V1-V9区16S rRNA基因测序，发现酸杆菌门相对丰度为1.5%-36.25%，其中subdivision 1（SD1）为优势类群。研究首次报道SD17和SD22在fynbos土壤中的存在，并通过β多样性分析证实土壤pH值、水分含量、有效磷、电导率（EC）和酶活性是驱动群落结构分化的关键环境因子。
摘要
开普植物区系作为全球生物多样性热点区域，其酸性贫营养土壤中酸杆菌门的生态功能尚未明确。本研究通过牛津纳米孔平台对26份土壤样本进行测序，发现酸杆菌门平均相对丰度为1.5%-36.25%，SD1在Kogelberg（66.96%±8.96%）和Jonkershoek（30.35%±0.15%）存在显著差异（p=0.001）。群落组成差异主要受土壤pH值、水分、有效磷、电导率和酶活性驱动，多项相关性分析揭示了酸杆菌门各亚群与土壤因子的密切关联。
1 引言
开普植物区系覆盖南非0.5%国土却蕴含非洲20%植物物种，其中fynbos生物群系以酸性贫营养土壤为特征。酸杆菌门作为1997年发现的细菌门类，目前划分为26个系统发育分支（subdivision, SD），已知培养物种不足100株。该门类在酸性贫营养环境中展现卓越适应性，其降解复杂碳水化合物的能力对fynbos生态系统的养分循环至关重要。前期研究表明酸杆菌门在fynbos土壤中相对丰度达4%-26%，但约40%的16S rRNA序列尚未分类，凸显该区域蕴含新分类单元的潜力。
2 材料与方法
2.1 研究区域与样本采集
经西部自然保护局许可（许可证号CN32-87-22071），于2023年1-3月在Jonkershoek（JHR）和Kogelberg（KGR）自然保护区采集26份土壤样本（JHR n=12, KGR n=14）。采样点避开植物根系，去除表层有机质后取0-10 cm土壤混合均匀。
2.2 土壤理化性质与酶活性分析
采用标准方法测定土壤水分、pH值（1:5水溶液）、电导率（EC）。氮矿化潜力通过第0天和第7天铵态氮浓度差值评估，硝酸盐检测采用水杨酸比色法，有效磷使用Bray II法测定，有机碳通过Walkley-Black法分析。酶活性检测包括β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside底物）、脲酶（720 mM尿素溶液）及酸/碱性磷酸酶（pNPP底物），微生物活性通过荧光素二乙酸酯（FDA）水解实验测定。
2.3 DNA提取与PCR扩增
使用ZR Quick-DNA土壤微生物试剂盒提取DNA，PCR扩增16S rRNA基因V1-V9区（引物27F/1492R）。反应体系含1× KAPA Taq Hotstart Buffer、1.5 mM MgCl2、0.5 μL dNTPs，扩增程序：95°C 5分钟；35个循环（95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 1分钟）；72°C终延伸1分钟。
2.4 条形码与文库构建
采用ONT原生条形码试剂盒（SQK-NBD114.96）进行末端修复和dA加尾，使用NEBNext模块20°C孵育5分钟、65°C 5分钟。连接条形码适配体后，通过长片段缓冲液选择1500-1900 bp片段，最终文库加载至R10.4.1流动槽进行测序。
2.5 扩增子序列数据处理
使用Nanoplot评估测序质量，去除引物序列、模糊碱基及超过8 bp的同聚体。通过MOTHUR进行序列聚类（97%相似度），以SILVA v1.32和EzBioCloud数据库进行分类（80%阈值），嵌合体序列经VSEARCH剔除。原始数据保存于GENBANK（登录号PRJNA1207934）。
2.6 数据分析
R语言环境下进行统计学分析。通过Shapiro-Wilk检验数据正态性，Microeco包计算α/β多样性指数，群落差异显著性采用PERMANOVA分析，酸杆菌门SDs与环境因子相关性通过Spearman秩检验评估（p<0.05为显著）。
3 结果
3.1 土壤理化性质与酶活性
两地土壤性质存在显著差异（表1）。KGR的pH值（5.71±0.61）、硝酸盐（10.67±8.16 mg/kg）、氮矿化（0.6±0.49 mg/kg）及碱性磷酸酶活性（639.29±141.66 μmol/g/h）显著高于JHR（p<0.01），而JHR的有效磷含量（1.13±0.45 mg/kg）更高（p<0.05）。
3.2 酸杆菌门多样性特征
3.2.1 丰度与α多样性
经质控获得77,074,902条序列，其中104,426条（35.14%）归属酸杆菌门。KGR的Shannon（4.29±0.23）和Simpson指数（0.973±0.973）显著高于JHR（p<0.01）。共鉴定23个酸杆菌门SDs，JHR以SD3（30.58%）和SD1（30.35%）为主，KGR中SD1占绝对优势（66.96%）（表3）。SD4、SD6在JHR丰度显著更高（p<0.01），SD7仅见于KGR，SD8为JHR特有。
3.2.2 β多样性
NMDS分析显示两地群落结构显著分离（p=0.001）（图3）。土壤pH值、EC、碱性磷酸酶和β-葡萄糖苷酶是主要驱动因子（图4）。相关性分析表明：KGR中SD1与EC（ρ=0.53）、碱性磷酸酶（ρ=0.56）、氮矿化（ρ=0.699）呈正相关；SD3与氮矿化（ρ=0.630）和脲酶（ρ=0.564）正相关；SD2与pH值负相关（ρ=-0.566），SD3与pH值正相关（ρ=0.711）。
4 讨论
4.1 酸杆菌门各亚群的丰度分布特征
本研究证实fynbos土壤蕴含丰富的酸杆菌门资源，其相对丰度最高达36.25%，显著高于既往报道（4%-26%）。SD1（Terriglobia纲）和SD3（Bryobacterales目）为优势类群，包含Acidipila、Candidatus Korobacter等已知属。群落结构差异主要受土壤pH值、养分有效性及酶活性调控，其中SD1和SD3在pH适应性方面呈现类群特异性：KGR中SD1随pH升高而增加，JHR中SD3与pH正相关，而SD2与pH负相关，体现同一SD内不同分类单元的环境适应性分化。
SD1所含磷代谢基因可能参与磷素活化，其与碱性磷酸酶的正相关性（KGR）暗示该群落在微碱性环境中的功能适应性。SD3成员（如Candidatus Solibacter）利用硝酸盐作为电子受体的特性，部分解释了其与氮矿化的正相关性。SD4（含Pyrinomonadaceae科）对几丁质的降解能力，为贫营养土壤提供了关键碳氮来源。SD5、SD6及特有SDs（SD7、SD8）的分布差异，进一步印证土壤性质对微生物群落的选择性塑造。
通过纳米孔测序首次检测到的SD17和SD22（相对丰度<1%），凸显新技术在稀有微生物发掘中的优势。但大量未分类序列（JHR 19.00%，KGR 1.54%）表明现有数据库对酸杆菌门多样性的覆盖仍存盲区。
5 结论
酸杆菌门在fynbos土壤中呈现高度多样性，其群落结构受pH值、酶活性等环境因子显著调控。不同SDs对环境条件的响应差异反映了该门类的功能多样性，而稀有SDs的发现提示fynbos土壤蕴含未知微生物资源。未来需通过培养组学与基因组学手段，深入解析酸杆菌门在寡营养生态系统中的功能机制。
作者贡献
Janca Pieters：课题设计、数据分析、实验操作、论文撰写；Karin Jacobs：项目管理、资源支持、论文修订；Tersia Andrea Conradie：研究构思、项目管理、论文指导。
致谢
感谢CapeNature及自然保护区管理人员对采样工作的支持。本研究未获得特定资金资助。
伦理声明
无相关声明。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性
测序数据公开于GenBank（登录号PRJNA1207934）。
