首例UBE2C酶活性肽类抑制剂的发现：基于元动力学引导的折叠与结合研究

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Identification of the first peptide inhibitor of UBE2C enzymatic activity: insights from metadynamics-guided folding and binding studies

本研究报道了首个靶向泛素结合酶UBE2C（UbcH10）的肽类抑制剂的结构设计与功能表征。通过多学科策略（生物化学、分子生物学、肽合成与计算模拟）发现先导肽5能以微摩尔亲和力结合UBE2C，并阻断UBE2C-Ub硫酯复合物形成。元动力学模拟揭示活性肽的瞬态β-折叠构象与结合能力相关，为靶向E2酶的癌症治疗策略提供了新思路。

　　

研究背景与意义

UBE2C（亦称UbcH10）作为泛素结合酶（E2）家族关键成员，通过调控细胞周期进程（如介导APC/C依赖的cyclin B1降解）在维持基因组稳定性中发挥核心作用。其在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症中过度表达，与肿瘤侵袭性及不良预后显著相关，因此成为抗癌药物研发的潜力靶点。然而，由于E2酶缺乏典型结合口袋，传统小分子抑制剂开发面临挑战，而肽类抑制剂因其高特异性及靶向蛋白-蛋白相互作用（PPI）的优势成为新兴策略。

肽抑制剂理性设计

本研究基于天然相互作用伴侣UBA1的UFD结构域片段U1（序列1038-LCCNDESGEDVEV-1050）进行结构优化。通过元动力学结合并行温度副本-良构系综（PT-WTE）模拟分析发现，天然肽U1在水溶液中主要以未折叠（U）构象存在，而晶体结构中观察到的β-折叠构象（U1_xr）为高能态。针对U1易聚集、难定量的问题，设计系列衍生物：肽2将半胱氨酸（C¹⁰³⁹/C¹⁰⁴⁰）替换为丝氨酸以增强亲水性；肽5进一步引入L1038W突变，通过色氨酸芳环提升疏水相互作用及紫外检测灵敏度；肽6作为阴性对照进行E1046Y突变以验证酸性残基必要性。

结合亲和力与特异性验证

微量热泳动（MST）实验显示，肽5与UBE2C结合亲和力最高（K_d=10 μM），与天然肽U1相当，而肽2亲和力降低至27.7 μM。AlphaScreen竞争实验进一步证实肽5与UBE2C的特异性结合，且剂量依赖性地抑制GST-UBE2C/生物素化肽5复合物形成。圆二色（CD）光谱表明所有肽在溶液中均呈无序构象，支持其通过“飞捕”（fly-casting）机制实现结合诱导折叠。

构象动力学与结合机制

PT-WTE模拟揭示肽5具有独特的自由能景观：其未折叠态（U）与部分折叠中间态（M）间能垒较低，促进瞬态β-折叠采样，利于与UBE2C的H1螺旋（含关键残基K³³、Q³⁶、Q³⁷）结合。分子对接与动力学模拟表明，肽5通过E¹⁰⁴⁶-K³³盐桥、D¹⁰⁴⁷/E¹⁰⁴⁹氢键及W¹⁰³⁸-M⁴⁴疏水作用稳定结合界面，MM/PBSA计算结合自由能低至–359.31 kJ/mol。相反，肽6因E1046Y突变丧失静电互补性，导致结合能力完全缺失。

功能抑制与稳定性评估

体外泛素化实验证实，肽5可浓度依赖性地抑制UBE2C-Ub硫酯复合物形成（25 μM–1 mM），而肽6无活性。血清稳定性实验显示肽5在人体血清中半衰期超24小时，降解产物仍保留部分活性，具备细胞实验潜力。

结论与展望

本研究首次报道了具有UBE2C酶活性抑制功能的肽类先导化合物，通过整合计算模拟与实验验证，阐明了其构效关系及作用机制。肽5的优化设计为靶向E2酶的癌症治疗提供了新范式，后续细胞水平验证将推动其向治疗应用转化。