测量总蛋白质含量在微藻研究中至关重要，因为它提供了关于生物量组成的重要信息，从而评估其在食品[1,2]、饲料[3,4]和燃料[5]应用中的潜力。蛋白质为食品和饲料中的生长、代谢和其他生物功能提供必要的氨基酸[6]。对于燃料生产而言，藻类生物燃料途径的经济可行性取决于提取油脂后的残余生物量的价值和组成[7]。
粗蛋白测定的方法通常分为直接法和间接法。间接方法（如凯氏定氮法[8]和杜马斯法[9]）通过测量总氮并应用氮与蛋白质的转换系数[10],[11],[12]来估计蛋白质含量。在凯氏定氮法中，样品与浓硫酸和催化剂一起消化，将有机氮转化为硫酸铵；然后测定释放的氨。在杜马斯法中，样品完全燃烧，将所有氮转化为气态氮氧化物，再将其还原为 N? 并进行定量。这些方法中的剧烈消化条件确保没有蛋白质无法被保留，这意味着蛋白质不会被坚固的细胞壁所屏蔽。
然而，这些间接方法需要氮与蛋白质的转换系数。一个显著的局限性是它们也会测量来自游离氨基酸、核酸和氨等化合物的非蛋白质氮（NPN）。凯氏定氮法中使用的经典转换系数 6.25 是基于纯蛋白质的平均氮含量[13,14]。因此，必须应用特定于样品的系数，这些系数通常较低或较高。这对于微藻来说是一个额外的复杂性，因为微藻含有较高的 NPN 成分（干重的 3–12%），并且这一比例会随生长条件而变化[5,15,16]。例如，S?gesser 等人的研究[15]表明，使用 Louren?o 等人之前为微藻推荐的 4.78 倍系数，估计的蛋白质含量在相应“真实蛋白质”含量的 91% 到 106% 之间。S?gesser 等人还提供了一种通过测量总氮、非蛋白质氮和蛋白质氨基酸来测定“真实蛋白质”的方法[15]。
相比之下，直接测量蛋白质的方法不受样品特定转换系数变化的影响。这些方法通常涉及从细胞中提取蛋白质，然后使用 Bradford、Lowry 或 Smith 等比色法进行定量。一个关键要求是有效破坏细胞壁以释放细胞内的蛋白质。在 Chlorella vulgaris 中，采用了多种技术来实现这一目的，包括珠磨、超声处理、高压均质化、脉冲电场、冻融、冻干以及化学或酶处理。虽然这些技术对细胞破坏有效，但它们的提取效率差异很大，机械方法的提取率为 46%，化学水解方法的提取率为 64%，而组合方法的提取率可高达 80%[17]。此外，破坏方法还会影响蛋白质向周围介质的扩散性，即使细胞壁已经被破坏[18]。对于 Chlorella 来说，一个显著的挑战是总蛋白质的 6–27% 与细胞壁结构结合在一起[19,20]。由于紧密结合和包裹作用，这部分蛋白质难以释放。因此，坚固且富含蛋白质的细胞壁以及破坏方法效率的不稳定性是提取后直接测定蛋白质的主要问题。这些困难促使人们探索不需要破坏细胞的方法[21,22]。
ninhydrin 与一级胺反应生成可溶性紫色染料（鲁曼紫（Ruhemann's purple）是一种成熟的氨基酸定量方法[23]。这一原理已被应用于在将蛋白质水解为其组成氨基酸后测量各种生物量和食品中的总蛋白质含量，同时仔细考虑了干扰物质[23],[24],[25],[26],[27]。这些协议通常使用酸水解（例如，在 110–130°C 下使用 6 N HCl）。碱性水解虽然较少见，但也有应用实例；例如，使用氢氧化钡水解了 19 种蛋白质，随后进行 ninhydrin 定量，显示出蛋白质质量与光学密度之间的恒定关系[28]。同样，Da Silva 等人报告使用 10 M NaOH 进行蛋白质水解，从胶原蛋白中几乎完全回收了羟脯氨酸[28]。
在这项研究中，我们探讨了一种使用 10 M NaOH 在室温下穿透 C. vulgaris 细胞的方法，溶解细胞内容物（包括游离氨基酸），以建立非蛋白质的背景信号。然后，我们评估了在这种条件下从水解蛋白质中定量氨基酸的可行性，并检查了潜在的误差来源。这种方法有几个优点：它消除了对样品特定转换系数的需求，完全破坏了细胞壁（与物理方法不同），从而将细胞壁中的蛋白质包含在测量范围内，不易受到破坏效果变化的影响，并且只需要少量的藻类生物量。
