在填充床反应器中生产对镰刀菌具有拮抗活性的粗糙毛壳菌（Trichoderma asperellum）

《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Production of Trichoderma asperellum in a packed-bed reactor with antagonist activity against Fusarium

真菌Trichoderma asperellum作为植物病害生物防控剂，其固体发酵过程中底物湿度和培养系统的影响研究不足。本研究比较了聚丙烯袋与打包床反应器系统中，小麦和水稻作为底物时的代谢响应及拮抗效果。结果显示：53%湿度的小麦底物在打包床中产孢量最高（4.56×108 conidia/g），且蛋白质及酶活性（淀粉酶、纤维素酶）优于水稻；两种系统产孢量相近，但打包床处理的拮抗效果更强（抑制率72%-85% vs 51%-78%）。该研究为优化固态发酵工艺提供了依据。

　　

Karina Romero-Hernandez|Gabriela Sepúlveda-Jiménez|Mario Rodríguez-Monroy

生物技术系，国家理工学院生物制品开发中心。CEPROBI街8号，San Isidro区，62731，Yautepec，Morelos，墨西哥

摘要

真菌Trichoderma asperellum是一种针对植物病原真菌的生物控制剂；然而，关于固体发酵过程中基质湿度对其代谢和拮抗反应的影响研究甚少，这正是本研究的目的。此外，还比较了在填充床反应器中产生的分生孢子与在聚丙烯袋培养中产生的分生孢子的抗真菌性能。两种系统中均使用小麦和水稻作为基质，分生孢子的产量大致相同（1.62×10⁸–2.06×10⁸ 分生孢子/g）。尽管如此，使用小麦时，菌丝生长和分生孢子形成更为均匀，且蛋白质含量以及淀粉酶和纤维素酶的活性高于使用水稻的情况。在含53%湿度的填充床反应器中，分生孢子产量最高（4.56×10⁸ 分生孢子/g），而蛋白质含量和酶活性则受到湿度增加的负面影响。分生孢子的存活率（97%）和发芽率（91%）未受湿度影响。T. asperellum在填充床反应器中产生的分生孢子能够抑制Fusarium属真菌的菌丝生长72–85%，而在袋装系统中产生的分生孢子则只能抑制51–78%。据我们所知，这是首次比较在两种不同配置下产生的Trichoderma分生孢子拮抗活性的研究。此外，研究结果还表明，在固体发酵条件下，湿度与T. asperellum的蛋白质代谢和酶活性之间存在关联。使用含53%湿度的填充床反应器是生产T. asperellum分生孢子的潜在选择。

引言

Trichoderma属真菌因其拮抗机制（包括菌寄生、抗菌作用以及对空间和养分的竞争）而被用作对抗病原真菌的生物控制剂。此外，Trichoderma真菌还能通过产生植物激素和铁载体以及溶解磷酸盐来促进植物生长。Trichoderma真菌还能在非生物胁迫条件下诱导植物的防御反应（Yao等人，2024；Manzar等人，2022；Al-Ani，2018）。含有Trichoderma的商业产品基于分生孢子的含量进行配制，因为分生孢子是耐受性结构，在温室和田间条件下施用于植物时仍能保持其活力和毒力（Jenkins和Grzywacz，2000），尽管这些产品也可能包含菌丝和厚垣孢子（Abdullah等人，2021；Dutta等人，2022）。通常，Trichoderma真菌通过液态发酵和固态发酵两种方法生产。在液态发酵中，真菌以悬浮菌丝的形式生长，这会增加培养液的粘度，阻碍养分、氧气和热量的传递，并可能导致颗粒形成（Klaic等人，2015；Sala等人，2019）。因此，有效的混合需要消耗更多能量，从而增加生产成本（Barzee等人，2021；Iram等人，2022）。固态发酵是一种更高效的方法，因为真菌在适当的湿度下在固体基质上生长。该方法比液态发酵所需的能量更少，从而使过程更具成本效益。然而，由于真菌在基质上的分布不均匀，控制过程参数（如养分水平、湿度、温度和pH值）颇具挑战性（Soccol等人，2017；Prabhu等人，2022；El Sheikha和Ray，2023）。对于固态发酵，常用的系统包括聚丙烯袋和带有棉塞的玻璃罐。这些系统依赖被动通风，与环境的气体交换有限，导致二氧化碳和其他气体的积聚，从而形成厌氧条件（Wang等人，2023）。为了解决这个问题，已经开发了带有强制通风系统的反应器，如填充床反应器、托盘反应器和旋转鼓反应器（Narra等人，2016；Arora等人，2018）。带有强制通风的填充床反应器有助于为好氧真菌生长提供氧气，去除有毒挥发性化合物，并促进热量散发（Mitchell等人，2023）。填充床反应器中的真菌孢子产量（1x10⁸至2.10x10¹⁰ 分生孢子/dm）显著高于塑料袋中的产量（2.3x10⁹至2.7x10⁹ 分生孢子/dm）（De la Cruz-Quiroz等人，2017；Rajput等人，2014；Barrera等人，2018；Ma?ga等人，2021；Sala等人，2022）。像Trichoderma这样的丝状真菌的生长依赖于填充床反应器中的通风和湿度；然而，关于这些因素如何影响Trichoderma产量的信息有限。因此，本研究确定了在填充床反应器中使用小麦和水稻作为基质生产Trichoderma asperellum分生孢子的条件，旨在获得对Fusarium属真菌具有活力的分生孢子。同时，还评估了基质湿度对蛋白质生成以及淀粉酶和纤维素酶活性的影响。

微生物的来源和培养条件

微生物的来源和培养条件

先前，Trichoderma asperellum的分离株是从Allium cepa（洋葱）中获得的，并由Ortega-García等人（2015）鉴定。Fusarium oxysporum和F. proliferatum的分离株来自洋葱，由Mejía（2015）鉴定，而Fusarium属的F1、F2和F3分离株则来自甘蔗。所有真菌分离株均储存在10%甘油中，温度为?20 °C。使用前，它们在含有马铃薯、葡萄糖和琼脂（PDA）的培养基的Petri皿中培养，温度为25 ± 2 °C。

发酵系统和基质对Trichoderma asperellum分生孢子产量和质量的影响

图1显示了使用水稻和小麦作为基质的T. asperellum在聚丙烯袋和填充床反应器中的生长情况。由于与谷物颜色的对比，T. asperellum在水稻中的菌丝生长更为明显（第2天）。此外，菌丝生长伴随着一些绿色区域的出现，表明T. asperellum在这些区域产生了孢子（第4天）。第8天，在小麦中，无论是袋装系统还是填充床反应器中，

讨论

使用小麦和水稻的两种发酵系统生产T. asperellum分生孢子的结果显示，分生孢子产量、发芽率和存活率没有显著差异。据报道，培养基中的碳氮（C:N）比例会影响真菌生长（Harman和Kubicek，2002）。对于本研究中评估的基质，C:N比例是根据美国农业部数据库（U.S.D.A.，2023）计算得出的，结果为水稻的C:N比例为30:1。

结论

带有通风和照明的填充床反应器为通过固态发酵生产T. asperellum提供了一个可控且可扩展的平台。通过优化基质湿度，可以最大化分生孢子的产量并保持其活力。研究表明，小麦是生产具有活力的分生孢子、蛋白质、淀粉酶和纤维素酶的合适基质。特别是，关于蛋白质生成与基质湿度之间关系的研究较少，我们的结果指出了这一点。

CRediT作者贡献声明

Karina Romero-Hernandez：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、概念化。Gabriela Sepúlveda-Jiménez：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、方法学、资金争取。Mario Rodríguez-Monroy：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、方法学、资金争取

未引用的参考文献

Kumar和Verma，2020；Sala等人，2024；美国农业部，2019；Yao等人，2023。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究由国家理工学院（IPN）的研究与研究生院（SIP-IPN）资助（项目编号20251031和20251021）。MR-M和GS-J感谢EDI和SIBE, IPN的支持。KRH感谢CONACYT提供的硕士学位奖学金。