《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms》：SP1 as a negative regulator of ADAMTS-8 in colorectal cancer: Evidence from functional and molecular analyses
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SP1通过直接结合ADAMTS-8启动子抑制其表达，促进结直肠癌和骨肉瘤进展，临床数据显示低ADAMTS-1与不良预后相关，Mitramycin A可逆转SP1对ADAMTS-8的抑制作用。
作者：Yasemin KALFA、Feyza Nur SAV、Meltem ALPER、Feray KOCKAR
土耳其巴勒克埃西尔大学（Balikesir University），科学与文学学院（Faculty of Science and Literature），分子生物学与遗传学系（Department of Molecular Biology and Genetics）
摘要
ADAMTS-8的表观遗传沉默与肿瘤侵袭性的增加和不良预后相关；然而，其在癌症中的转录调控机制仍很大程度上尚未明确。本文全面研究了SP1对ADAMTS-8的转录调控作用，而SP1与结直肠癌（CRC）的不良临床结局相关。在CRC的临床和分子亚型中，SP1的水平呈显著上升趋势。功能分析表明，SP1在SW480细胞中的过表达会促进细胞增殖和迁移；相反，它会显著抑制ADAMTS-1和ADAMTS-8的表达。此外，这种抑制作用可以通过米托霉素A（Mitramycin A）逆转。荧光素酶报告基因实验（Luciferase reporter assays）证实了SP1对ADAMTS-8启动子活性的转录抑制作用。ChIP-qPCR和EMSA实验表明SP1特异性结合到ADAMTS-8的启动子区域（?56/+17），说明存在直接的调控机制。临床分析显示CRC患者中ADAMTS-1的水平显著降低，而ADAMTS-1水平低与较差的生存率相关。进一步研究发现在骨肉瘤（osteosarcoma）中，SP1的表达相对于成骨细胞（osteoblasts）显著升高，而ADAMTS-8的表达则受到明显抑制。TCGA-SARC队列中的数据支持SP1在骨肉瘤中的肿瘤抑制作用。qRT-PCR实验也证实了SP1对SAOS-2细胞中ADAMTS-8的抑制作用。
总体而言，我们的研究结果表明SP1是ADAMTS-1和ADAMTS-8的关键负调控因子，促进了CRC和骨肉瘤的肿瘤进展。SP1–ADAMTS轴可能是癌症生物学中一个重要的分子网络，为开发新的生物标志物或靶向治疗策略提供了基础。
引言
结直肠癌（CRC）是最常见的癌症类型之一，对全球健康构成重大威胁[1]。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2020年全球新增CRC病例超过190万例，相关死亡人数超过93万例[2]。这种癌症无论性别如何都是第二大致命的恶性肿瘤，每年占癌症诊断总数的11%，导致约180万新病例[3]。据估计，到2030年，CRC的新增病例将超过220万例，死亡人数将超过110万例[4]。
由于蛋白酶介导的细胞外基质（ECM）降解对于肿瘤细胞突破组织屏障至关重要，多项研究表明细胞外基质在CRC的表型中起着重要作用，尤其是在肿瘤转移过程中[5]。越来越多的证据表明，肿瘤的生成、生长和转移严重依赖于诸如ADAMTSs（具有血栓蛋白酶结构域的解整合素和金属蛋白酶）这样的蛋白酶，这些蛋白酶与基质金属蛋白酶（MMPs）密切相关。这些蛋白酶分子参与多种生物过程，包括ECM重塑、膜结合蛋白的脱落、细胞黏附、细胞融合、侵袭、蛋白水解和催化作用[6]。19个成员组成的ADAMTS家族影响着多种生物学过程，包括血管生成、迁移、增殖和癌症发展[7]。其中，ADAMTS-8家族成员在多种癌症类型中具有重要的调控功能[8]。恶性肿瘤的侵袭性和不良预后通常与其ADAMTS-8基因的低表达或表观遗传沉默有关。研究表明，ADAMTS-8可诱导细胞凋亡、抑制侵袭和转移、减少CRC细胞的增殖并调控肿瘤生长[9, [10], [11]]。SP1是一种转录因子，在细胞周期调控和多种基因的转录激活中起关键作用[12,13]。SP1的DNA结合结构包含三个锌指结构，能够识别富含GC序列的基序（GC/GT框），它结合到缺乏TATA框的启动子区域，帮助RNA聚合酶II定位到正确位置并启动转录[14]。SP1通过促进细胞进入S期并增强其稳定性来促进细胞增殖[15]。在胃癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、肺癌和卵巢癌等多种癌症中，SP1的表达水平较高，且常与转移和不良预后相关[16,17]。
本研究利用CPTAC-UALCAN数据分析了SP1在CRC临床和分子亚型中的表达情况，发现SP1在黏液性肿瘤、受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路异常以及晚期肿瘤中的水平升高。在SW480细胞中，SP1的过表达增加了细胞的增殖和迁移能力，同时显著降低了ADAMTS-8及其抗血管生成家族成员ADAMTS-1的mRNA和蛋白质水平。这种抑制作用可以通过米托霉素A逆转。在另一种癌症模型——骨肉瘤（SAOS-2）细胞中，SP1的抑制作用也导致ADAMTS-8表达下降。启动子分析、基因删除、ChIP和EMSA实验证实SP1直接结合到ADAMTS-8的启动子区域并抑制其转录。这些发现首次揭示了SP1对ADAMTS-8基因的调控作用，为SP1在ADAMTS-8基因调控中的潜在作用提供了有力证据。
生物信息学分析
SP1蛋白的表达数据来自UALCAN数据库，结肠癌样本根据组织学亚型、分子亚组、肿瘤分期和临床亚组进行分类。表达水平使用Z-score标准化，并以箱形图呈现。利用JASPAR和PROMO数据库[18]分析了可能结合到ADAMTS-8启动子的潜在转录因子，分析范围为?854/+323 bp区域。
肿瘤样本中的ADAMTS-1表达与正常结肠组织相当
SP1蛋白在结肠癌的临床和分子亚型中的表达呈上升趋势
利用UALCAN平台通过CPTAC数据分析了SP1蛋白的表达情况。根据组织学亚型分类，发现黏液性肿瘤中的SP1表达与非黏液性肿瘤不同（图1A）。对RTK通路分子改变的分析显示，具有该通路遗传改变的肿瘤中SP1水平升高（图1B）。根据病理分期进行的检测也证实了这一趋势
讨论
ADAMTS-8（也称为METH-2）与ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5和ADAMTS-15具有高度序列相似性。它已被确认为具有多种癌症类型中关键调控作用的肿瘤抑制基因。ADAMTS-8的低表达或表观遗传沉默与癌症的侵袭性增强和不良预后相关[31,32]。最新研究表明，ADAMTS-8在结直肠癌细胞系和原发肿瘤组织中的表达显著降低。相比之下，其在其他组织中的表达则较高
作者贡献声明
Yasemin KALFA：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、结果分析。
Feyza Nur SAV：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、结果分析。
Meltem ALPER：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、结果分析、概念构思。
伦理批准
本文未涉及使用动物或人类进行的研究，因此无需伦理批准。
资助
Yasemin KELE?获得了土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）的2211-E国内博士奖学金计划的支持。
利益冲突声明
作者没有需要披露的财务或非财务利益关系。
致谢
Sreeparna BANERJEE教授（土耳其安卡拉中东技术大学）慷慨提供了SW480细胞。
