《Food Microbiology》：Aldo/Keto Reductase Regulates L-lactate Dehydrogenase Activity as a Key Target for Yogurt Post-acidification
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后酸化抑制机制及三元复合物作用研究。通过非靶向代谢组学发现烟酸（NA）抑制酸奶后酸化过程中乳酸等有机酸积累，酵母双杂交筛选出21个与AKR互作蛋白，鉴定L-LDH为关键调控靶点。实验证实NA通过诱导AKR-L-LDH-NA三元复合物抑制L-LDH活性，为发酵乳制品质量控制提供新靶点。
穆青青|贾思彤|李东瑶|赵文豪|张娜|王淼舒|田洪涛|陈莉
河北农业大学食品科学与技术学院，中国河北省保定市，071000
摘要
冷藏过程中的后酸化是决定酸奶品质的关键因素。尽管已知烟酸（NA）可以通过保加利亚乳杆菌中的醛酮还原酶（AKR）影响这一过程，但其精确的调控机制仍不清楚。通过非靶向代谢组学分析发现，烟酸改变了储存过程中的代谢谱，显著减少了L-乳酸、富马酸和琥珀酸等有机酸的积累。这表明后酸化过程是通过相关代谢途径被抑制的。同时，酵母双杂交筛选鉴定了21种与AKR相互作用的蛋白质，确认L-乳酸脱氢酶（L-LDH）是AKR的关键相互作用伙伴。该酶直接调节L-LDH的活性。随后的酶活性测定和AKR突变实验证实，烟酸通过促进AKR-L-LDH-NA三元复合物的形成来强效抑制L-LDH的活性。通过不改变L-LDH的结构和内在催化特性来调节其活性，有望将AKR-L-LDH-NA三元复合物作为未来调控后酸化过程的关键靶点。本研究建立了一种准确调控酸奶后酸化的技术方法，为控制乳酸发酵食品的酸度提供了理论基础。
引言
酸奶是一种广泛消费的发酵乳制品，因其丰富的营养成分而受到重视（Xue等人，2024年）。它通常使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵剂进行生产（Savaiano & Hutkins，2021年）。在储存过程中，酸奶容易发生后酸化，导致风味恶化并缩短保质期（Deshwal等人，2021年）。虽然传统的减缓后酸化的方法有一定效果，但存在显著局限性，包括冷链维护的高能耗（Zhang等人，2024年）以及热敏性生物活性肽和益生菌的降解（Deshwal等人，2021年）。使用批准的食品添加剂是一种可行的替代方案，可以在不损害感官品质的情况下控制发酵乳制品的后酸化（Deshwal等人，2021年）。先前的研究表明，添加烟酸（NA）可以减轻酸奶储存（4°C，21天）期间的pH值下降，并延长产品保质期（Zhang等人，2022年）。然而，NA抑制发酵乳中后酸化的具体机制仍不完全清楚。
烟酸作为一种参与多种关键代谢途径的食品添加剂（Kong等人，2017年），作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的基本前体（Yaku等人，2025年），其对发酵乳中后酸化的影响必然会体现在代谢谱的变化上（Lv等人，2020年）。为了全面研究酸奶中的代谢物变化，非靶向代谢组学为分析发酵和储存过程中微生物代谢物的动态变化提供了强有力的方法（Sun等人，2023年；Zheng等人，2024年；Rodrigues等人，2024年；Yang等人，2025年）。类似的研究表明，使用唾液乳杆菌 CCFM 1266进行发酵会改变酸奶中的挥发性风味化合物和代谢物谱（Yan等人，2024年）；非靶向代谢组学在添加菊粉的共生酸奶中鉴定出多种差异丰富的代谢物（Zhou等人，2025年）。
向酸奶中添加烟酸显著下调了
LDB_RS00370的表达（Zhang等人，2022年），表明其在通过NAD
+/NADH辅酶系统调节中心碳代谢流方面的潜在作用。
LDB_RS00370编码一种醛酮还原酶（AKR），这是一种广泛参与辅因子代谢和次级代谢物合成的多功能酶类（Jangra等人，2023年；Penning等人，2021年；Andress Huacachino等人，2024年）。已知微生物AKR具有重要的生理和代谢功能（Ellis等人，2002年）。例如，
鲁特尔乳杆菌 DSM20016中的多种AKR有助于香气的形成（Qu等人，2022年），而
植物乳杆菌DSM20174中的LP-AKR5和LP-AKR9在弱酸性条件下保持高催化活性和产品稳定性（Zhu等人，2023年）。尽管先前的研究已经确定烟酸会影响LDB_RS00370的表达和后酸化过程（Zhang等人，2022年），但之前的研究主要集中在烟酸引起的基因表达全局变化上（Pei等人，2025年）。这种醛酮还原酶在酸奶后酸化中的具体功能尚不明确，其蛋白质水平的调控机制需要系统研究。为填补这一知识空白，我们采用了酵母双杂交（Y2H）技术来阐明AKR的功能作用，并澄清NA调控的蛋白质网络中的分子相互作用。这种方法旨在从蛋白质水平上更深入地理解烟酸抑制酸奶后酸化的机制。本研究旨在阐明AKR在乳酸菌代谢中的调控作用。我们使用非靶向代谢组学分析了烟酸引起的代谢谱变化，特别是有机酸的变化，从而在代谢物水平上表征了NA抑制酸化的生理过程。通过Y2H高通量筛选，我们鉴定了AKR的潜在蛋白质相互作用伙伴，并结合生物信息学分析，研究了这些目标蛋白质与AKR在分子水平上的结合机制和动态相互作用。这项工作不仅揭示了AKR调节L-LDH活性是酸奶后酸化的关键靶点，还为提高乳酸菌发酵控制的工业应用提供了有价值的见解。
材料与试剂
脱脂奶粉购自内蒙古伊利集团有限公司。保加利亚乳杆菌亚种Bulgaricus ATCC 11842由中国普通微生物菌种保藏中心提供。冻干菌株在De Man, Rogosa和Sharpe（MRS）琼脂培养基（Aoboxing Biotechnology Co., Ltd.）中重新激活并传代。
引物设计
引物使用Primer Premier 5.0软件（PREMIER Biosoft，美国）设计，并由上海Prime Biological公司商业化合成。
烟酸对市售酸奶储存期的影响
在4°C下储存21天期间，所有酸奶样品的滴定酸度（TA）均显著增加（图1A），pH值逐渐下降（图1B）。值得注意的是，S-NA处理组（210 mg/kg）的pH值显著高于未处理对照组（P < 0.05）。尽管所有样品的TA值从第0天到第21天都有所增加，但S-NA组的增加速率明显低于S对照组。S-NA组始终
结论
酸奶储存过程中的后酸化是影响产品质量的重要因素。本研究表明，烟酸能有效延缓后酸化，处理组在关键质量参数（包括pH值、滴定酸度（TA）、持水能力（WHC）、活菌数和感官评价）方面表现优于对照组。代谢组学分析显示，烟酸补充改变了酸奶的代谢谱
作者贡献声明
田洪涛：监督、方法学、资金获取、概念构思。穆青青：撰写——初稿、可视化、验证、正式分析。赵文豪：验证、数据管理。张娜：验证、数据管理。贾思彤：撰写——审稿与编辑、软件使用。李东瑶：验证、数据管理。王淼舒：验证、数据管理。陈莉：监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思
未引用参考文献
C等人，2022年；Dave和Shah，1997a；Dave和Shah，1997b；Ellis，2002年；Huang等人，2020年；Shaw，2006年；Wang等人，2025年；Wang等人，2025年；Zhang等人，2022年。
伦理声明
所有参与感官评估的研究人员均签署了知情同意书。该方案已获得河北农业大学机构伦理委员会的批准。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32472359）和河北省自然科学基金（项目编号：C2023204036）的资助。
