化学蛋白质组学揭示了细菌对抗生素介导的活性氧（ROS）反应的机制

《Free Radical Biology and Medicine》：Chemical proteomics reveals mechanisms of bacterial response to ROS mediated by antibiotics

抗生素诱导的活性氧物种（ROS）通过特异性半胱氨酸残基修饰调控大肠杆菌蛋白功能及耐药性机制研究

林福|刘少伟|田彩萍|杨静

国家蛋白质科学中心（北京）医学蛋白质组学国家重点实验室，邮编102206，中国

摘要

活性氧（ROS）在抗生素介导的细菌杀灭作用及抗生素耐药性出现中的作用尚未完全明了，尤其是特定蛋白质靶标的身份及其功能影响。为了解决这一问题，我们采用基于位点的化学蛋白质组学方法，研究了大肠杆菌（Escherichia coli）在接触八种不同抗生素后的半胱氨酸组（cysteinome）的动态变化。功能分析表明，这些对氧化还原反应敏感的蛋白质参与到了氨基酸生物合成和氧化还原稳态等关键细胞过程中。进一步的研究表明，抗生素诱导的ROS直接调控了特定的半胱氨酸残基：MnmA中的C102、NemR中的C116以及TyrR中的C337，通过影响酶活性、诱导二聚化以及调节基因表达等方式改变了这些残基的功能。这些由氧化还原反应介导的功能变化最终决定了大肠杆菌对抗生素的敏感性。我们的发现建立了抗生素诱导的ROS、关键蛋白质中的特定半胱氨酸修饰与细菌存活之间的直接分子联系，为提高抗生素疗效提供了新的策略框架。

部分内容摘录

背景

全球抗菌素耐药性危机对公共卫生构成了严峻挑战，这凸显了迫切需要更好地理解抗生素的作用机制[1]。涉及特定靶点结合的抗生素作用模式已得到充分研究[2]。同时，在阐明抗生素疗效与细菌代谢之间的复杂相互作用方面也取得了显著进展[3, 4]。除了这些经典模型之外，最近的研究还揭示了更多

细菌菌株、质粒和生长条件

本研究中使用的所有细菌菌株和质粒详见补充数据1。主要菌株为大肠杆菌（E. coli MG1655（ATCC编号700926），所有衍生菌株均保存在15%（v/v）甘油溶液中，置于-80°C条件下。常规培养时，大肠杆菌在37°C下于Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）中培养，并进行220 rpm的搅拌；或在LB琼脂平板（1.5% w/v琼脂）上培养。针对特定实验，菌株则在M9最小培养基中培养

引物

本研究使用的引物列表见补充数据1。

抗生素抑制伴随着蛋白质半胱氨酸组的氧化还原状态变化

为了研究抗生素对大肠杆菌的影响，我们用八种不同的抗生素（氨苄西林（Amp）、氯霉素（Chlo）、庆大霉素（Gent）、卡那霉素（Kan）、诺氟沙星（Nor）、多粘菌素B（PMB）、壮观霉素（Spec）、四环素（Tet）处理MG1655菌株，这些抗生素涵盖了喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、多粘菌素类和四环素类五大抗生素类别，使用浓度为其最低抑菌浓度（MIC）的5倍。正如预期的那样，任何一种抗生素处理4小时后

讨论

许多抗生素的杀菌活性与活性氧（ROS）的生成密切相关，ROS主要通过氧化修饰蛋白质中的关键半胱氨酸残基来发挥作用。这种修饰可以像分子开关一样，改变蛋白质的结构和功能，进而影响细胞的命运[38]。尽管这一机制已被广泛认可，但对于抗生素作用过程中具体半胱氨酸靶点及其功能角色的系统级理解仍需进一步深入

CRediT作者贡献声明

刘少伟：方法学设计、数据分析。 林福：初稿撰写、资源获取、方法学设计、实验实施、资金申请、数据分析。 杨静：审稿与编辑、实验监督。 田彩萍：资源准备、方法学设计

数据获取

本研究生成的质量谱蛋白质组学数据已存储在iProX数据库中，可通过访问代码PXD046916公开获取。支持本研究结果的所有其他原始数据，包括图表来源数据，均包含在文章及其补充信息文件中。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFA1303000）对L.F.的支持，以及国家自然科学基金（编号31800036和32270126）对L.F.的资助。感谢北京生命组学研究所的S.Chen和B.Fu提供的专业技术支持。