《Frontiers in Immunology》：Acetylsalicylic acid disrupts SARS-CoV-2 spike protein glycosylation and selectively impairs binding to ACE2
引言
冠状病毒病2019（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的一种传染性疾病。在约80-90%的感染者中，SARS-CoV-2感染主要局限于上呼吸道，表现为具有轻度流感样症状的自限性疾病。在其余病例中，异常的免疫反应促进病毒在下呼吸道不受控制地复制，导致肺炎和急性呼吸窘迫综合征。在这些严重形式中，病毒向远端器官的全身性传播导致内皮损伤、微血栓并发症、多器官衰竭和死亡。
在门诊环境中对轻度至重度COVID-19的发作进行干预，为防止疾病进展和长期并发症提供了机会。最近的临床证据表明，抗炎药，特别是非甾体抗炎药（NSAIDs），代表了一种有前景的限制COVID-19严重程度的治疗方法。在这些化合物中，阿司匹林（乙酰水杨酸，ASA）已被证明可以降低COVID-19患者的住院死亡率和严重结局，这在涉及数千名患者的几项回顾性分析和荟萃分析中均有报道，尽管结果好坏参半。
ASA的主要作用机制归因于其乙酰化环氧合酶-2（COX-2）和COX-1活性位点丝氨酸残基的能力，从而抑制它们的活性。通过靶向COX-2，ASA减少了前列腺素的产生，前列腺素是炎症反应的关键介质。同时，抑制血小板中的COX-1会减少血栓烷A2（TxA2）的合成，这是一种促进血小板聚集和血管收缩的关键分子。这种抗血栓形成效应使ASA成为预防严重疾病中血栓栓塞事件的候选药物，而血栓栓塞事件与COVID-19死亡风险密切相关。
除了这些抗炎和抗血栓形成作用外，ASA已证明对多种RNA病毒具有直接抗病毒活性，包括肝炎病毒、黄病毒、轮状病毒和呼吸道病毒，以及DNA病毒如水痘-带状疱疹病毒和巨细胞病毒。在COVID-19背景下，有证据表明ASA在细胞培养和离体人精准切割肺切片模型中均能抑制SARS-CoV-2的复制。这些研究揭示，ASA通过多种机制发挥抗病毒活性，包括抑制病毒复制、乙酰化病毒或宿主蛋白、抑制核因子κB（NF-κB）信号传导以及调节宿主代谢和翻译后途径，最终限制病毒转录和组装。
虽然这些发现主要集中于ASA调节病毒复制或减弱宿主细胞反应的细胞内机制，但ASA是否能直接干扰病毒刺突蛋白与其受体血管紧张素转换酶2（ACE2）之间的相互作用仍不清楚。阻断S1–ACE2相互作用尤为重要，因为在重症患者中检测到高水平的循环SARS-CoV-2抗原，特别是刺突蛋白S1亚基（S1）。此外，ACE2在多个器官中的广泛分布使得S1能够与受体结合并激活有害的信号通路，从而导致全身症状和多器官受累，例如心肺表现。此外，在长新冠（long-COVID）的急性后遗症中也检测到循环S1。例如，刺突蛋白在颅骨-脑膜-脑轴的持续存在与长新冠的神经系统后遗症相关。因此，在SARS-CoV-2感染期间阻断刺突–ACE2相互作用，对于减轻呼吸道以外病毒入侵引起的全身并发症可能具有治疗意义。
本研究旨在探讨ASA对SARS-CoV-2刺突蛋白的潜在影响，特别评估其干扰刺突–ACE2结合的能力。阐明这种潜在的作用模式对于重新利用ASA作为一种可负担的治疗选择至关重要，因为破坏刺突–ACE2结合可以预防导致器官损伤、血栓形成以及与SARS-CoV-2感染相关的长期并发症的下游级联反应。
结果
ASA处理以剂量依赖性方式降低重组SARS-CoV-2 S1蛋白的细胞表面结合
为了评估ASA改变S1与ACE2结合的能力，研究人员开发了一个使用Vero细胞的体外系统。首先评估了不同浓度的S1蛋白对Vero细胞的影响。结果显示，在存在无关同种型抗体的情况下，Vero细胞暴露于浓度递增的S1（10、20和50 nM）24小时后，细胞活力呈剂量依赖性下降。相反，与抗ACE2阻断抗体共孵育可有效预防10和20 nM S1的细胞毒性。然而，尽管有ACE2阻断，50 nM S1仍诱导细胞活力显著降低，表明在该剂量下，S1的细胞毒性可能通过ACE2非依赖性机制发生。
确定了诱导ACE2依赖性毒性的S1浓度后，选择使用20 nM S1进行后续实验。通过免疫荧光分析，观察到20 nM S1蛋白与Vero细胞顶膜的显著结合。在此背景下，研究了ASA是否能降低S1的结合亲和力。将S1蛋白与浓度递增的ASA（5、20和50 mg/L）孵育过夜，这些浓度在口服500–1000 mg ASA可达到的血浆水平范围内。结果显示，ASA预处理能够以剂量依赖的方式显著抑制S1与Vero细胞的结合。值得注意的是，当S1与另一种化合物扑热息痛（paracetamol）孵育时，未观察到这种抑制效应，表明ASA的作用具有特异性。
为了进一步证实ASA在阻断S1和ACE2相互作用中的直接作用，研究人员建立了一种基于ELISA的结合试验。具体而言，将经或未经浓度递增的ASA处理的S1蛋白固定在ELISA板上，然后与重组人ACE2-Fc融合蛋白孵育，使用HRP标记的抗人Fc二抗检测ACE2与S1的结合。在这种设置下，ASA处理足以以剂量依赖的方式损害S1-ACE2结合效率，在20 mg/L的剂量下结合减少高达50%。该实验设置还使研究人员能够评估ASA对检测抗体与S1结合的直接影响，结果表明这种影响是微乎其微的。
总之，这些结果表明ASA以剂量依赖的方式特异性损害S1蛋白与ACE2的结合，无论是在基于细胞的还是无细胞的系统中，都支持ASA对S1和ACE2之间分子相互作用的直接影响。
ASA处理抑制具有复制能力的SARS-CoV-2的结合，限制其细胞病变效应
为了进一步验证ASA在破坏刺突蛋白与ACE2相互作用方面的潜在直接影响，研究人员在Vero细胞中进行了具有复制能力的SARS-CoV-2的细胞病变试验。相位差显微照片显示，单独接种SARS-CoV-2阳性鼻咽拭子样本4天后，在Vero细胞中诱导了明显且广泛的细胞病变效应，其特征是广泛的细胞变圆、合胞体形成和从培养基底脱落，表明显著的病毒复制和随后的细胞损伤。相反，当SARS-CoV-2阳性病毒样本与20 mg/L ASA预孵育后，细胞病变效应被显著消除。在这些条件下，Vero细胞单层在很大程度上保持了其完整性，表现出健康、融合的外观，具有特征性的扁平、多边形细胞形态，与未感染的对照细胞相当。重要的是，单独使用ASA对Vero细胞单层的完整性没有可检测到的影响。
总的来说，这些结果证明了ASA能够减弱SARS-CoV-2在Vero细胞中诱导的细胞病变效应，突出了其在易感细胞中阻断病毒-宿主细胞相互作用的潜力。
ASA处理限制S1在表达人ACE2的转基因小鼠中的致病效应
为了验证用ASA处理S1是否能阻断其与ACE2的结合，从而限制器官损伤，研究人员采用了一个生物学相关的体内模型，即在表达人ACE2的转基因小鼠（hACE2-KI）中由SARS-CoV-2 S1蛋白诱导的急性肺损伤模型。向小鼠气管内滴注15 μg在生理盐水中或与20 mg/L ASA预孵育过夜的S1。苏木精-伊红（H&E）染色显示，与接受载体（vehicle）的hACE2-KI小鼠相比，滴注经生理盐水预处理的S1的小鼠在7天后肺组织切片出现显著的组织学变化。特别是，S1处理的小鼠表现出肺泡腔扩张和肺泡隔增厚，伴随肺泡实质内以及血管、血管周围部位和扩散到更大间质区域的肺组织细胞增多。这些组织学异常在接受与ASA预孵育的S1的hACE2-KI小鼠肺部得到显著减弱。
为了进一步评估ASA对S1在肺部致病性的影响，进行了Masson三色染色以评估实验组间的细胞外基质重塑。接受载体的小鼠肺部表现出保存完好的肺泡结构，无基质沉积。相反，滴注经生理盐水预处理的S1的小鼠显示出大量弥漫的品红阳性信号，反映了强烈的细胞外基质积累，以及苯胺蓝染色，表明成熟胶原纤维增加。S1与ASA预孵育减少了hACE2-KI小鼠肺部的品红阳性和苯胺蓝阳性区域，表明ASA具有减少S1诱导的促纤维化过程的能力。
为了更深入地了解ASA处理如何影响S1诱导纤维化的能力，研究人员检测了纤连蛋白（fibronectin）的表达，这是新生纤维化重塑的标志，是提供胶原沉积支架的主要基质成分。免疫荧光分析显示，与接受载体的小鼠相比，滴注经生理盐水预处理的S1的小鼠肺部纤连蛋白表达显著增加。值得注意的是，与ASA预孵育的S1表现出降低的促纤维化活性，这通过hACE2-KI小鼠肺部纤连蛋白表达显著减少得到证明。
接下来，研究人员研究了这些效应是否在功能上转化为炎症细胞浸润的减少。为此，在S1滴注7天后，对肺组织中的MAC2+巨噬细胞和GR1+中性粒细胞进行了免疫荧光分析。对MAC2+和GR1+细胞的定量分析显示，与接受载体的小鼠相比，滴注经生理盐水预处理的S1的小鼠肺部巨噬细胞和中性粒细胞显著积聚。S1与ASA预孵育有效抑制了hACE2-KI小鼠肺部炎症细胞的浸润。
为了排除预处理S1制剂中存在的ASA是产生保护效应的可能性，另一组动物接受未经处理的S1气管内滴注，随后立即通过相同途径给予15 μl ASA 20 mg/L。在这种条件下，S1随后ASA气管内给药仍诱导了肺损伤、纤维化和炎症细胞浸润。这种保护的缺乏证实了ASA是通过直接结构修饰S1蛋白起作用，并排除了ASA在该急性滴注模型背景下间接的抗炎效应。
总之，这些发现表明ASA有潜力干扰S1蛋白与ACE2之间的相互作用，从而减轻S1在表达ACE2的组织中诱导的损伤，并限制其广泛的致病效应。
ASA处理改变S1的糖基化谱
为了阐明ASA抑制S1与ACE2结合的机制，研究人员将重点放在S1蛋白的糖基化上。这一假设基于S1蛋白的广泛糖基化，其在刺突蛋白折叠、免疫逃逸和ACE2结合中起着关键作用，再加上先前报道的ASA的抗糖化活性。为了验证这一点，研究人员对天然状态下的S1以及用20 mg/L ASA处理后的S1进行了糖蛋白组学分析，以全面定义任何潜在的ASA诱导的糖基化变化。如图所示，天然S1蛋白显示出8个N-连接和25个O-连接糖基化位点。在实验条件下，ASA处理选择性地减少了N61残基（位于N端域，NTD）的N-连接糖基化。除此之外，ASA还限制了刺突蛋白不同结构区域中多个丝氨酸和苏氨酸残基的O-连接糖基化。具体来说，研究人员观察到NTD中的T250、RBD内的S325和S494、以及亚域1（SD1）和亚域2（SD2）中的T572和T645的O-连接糖基化减少。
考虑到ASA诱导赖氨酸残基非酶促乙酰化的公认能力，接下来检测了观察到的S1糖基化变化是否伴随S1蛋白的化学修饰。为此，评估了S1暴露于浓度递增的ASA后的乙酰化情况。结果显示，ASA诱导了S1乙酰化的强劲剂量依赖性增加。这种修饰在最低测试浓度（5 mg/L）下就很明显，并在20 mg/L和50 mg/L时显示出逐渐强烈的富集。
总之，这些结果表明ASA通过潜在的乙酰化依赖过程重塑了S1蛋白的N-和O-连接糖基化，从而削弱了其与ACE2结合的能力。
定点诱变证实N61和S325糖基化在介导S1与ACE2相互作用中的关键作用
在ASA修饰的所有糖基化位点中，两个特定的残基，即N61和S325，先前已被描述为S1-ACE2相互作用的潜在调节因子。为了评估N61和S325糖基化在S1与ACE2结合中的直接贡献，研究人员通过基于PCR的方法对S1蛋白进行了定点诱变。使用含有SARS-CoV-2刺突S1开放阅读框的pUNO1His-SARS2-S1质粒作为模板。研究人员引入了天冬酰胺61到天冬氨酸（N61D）的靶向氨基酸替换以破坏N-连接糖基化，以及丝氨酸325到丙氨酸（S325A）的替换以消除O-连接糖基化。除了N61D质粒，还使用N61D质粒作为第二轮诱变的模板，生成了双突变体（N61D/S325A）。桑格测序证实了两个残基的正确突变。将转染相应质粒的ExpiCHO细胞中纯化的WT和突变蛋白，通过Western印迹分析确认了正确的蛋白表达和纯化。将得到的突变蛋白用作ELISA测定中的包被抗原，以评估ACE2结合效率。在该实验设置中，与WT对应物相比，具有N61D突变的S1蛋白显示出ACE2结合效率的部分降低。值得注意的是，同时含有N61D和S325A替换的双突变体（N61D/S325A）比单N61D突变表现出更显著和统计学意义的ACE2结合效率降低。
总之，这些发现提供了直接证据，表明同时破坏N61和S325的糖基化是触发显著的S1结构重排、阻碍ACE2的识别或可及性所必需的。
双S1突变体在表达人ACE2的转基因小鼠中致病效应有限
为了评估由N61D/S325A双突变引起的ACE2结合减少是否影响S1蛋白在体内的致病性和器官损伤，研究人员将突变的重组S1气管内滴注到hACE2-KI小鼠体内。与S1 WT形成鲜明对比的是，滴注S1 N61D/S325A双突变体7天后，肺组织的H&E染色显示组织病理学特征显著减弱。具体来说，这些小鼠的肺部表现出保存良好的肺泡结构，肺泡壁增厚最小，并且没有弥漫性实质细胞增多或血管充血的证据。一致地，Masson三色染色显示，与S1 WT诱导的广泛重塑相比，暴露于突变S1蛋白的肺部胶原沉积几乎完全缺失，仅存在稀疏的品红和苯胺蓝阳性区域。这与接受S1 N61D/S325A双突变体的小鼠肺部纤连蛋白表达显著减少相平行。此外，对炎症细胞的分析显示，与S1 WT相比，接受S1 N61D/S325A双突变体的小鼠肺部MAC2+巨噬细胞和GR1+中性粒细胞的浸润有限，细胞计数与载体处理的小鼠相当。与体外数据一致，单突变体S1 N61D在体内减少致病性的效果不如双突变体。实际上，S1 N61D诱导的肺损伤、纤维化和炎症细胞浸润水平与S1 WT相当，强调了保护表型是N61D/S325A双替换所特有的。
总之，这些结果表明，N61D/S325A双突变（而非单突变体S1 N61D）模拟了用ASA处理的S1所观察到的保护效应，有效预防了野生型S1诱导的器官损伤和致病反应，进一步强调了所选位点的特异性和功能相关性。
讨论
在本研究中，研究人员确定了ASA的一种新型抗病毒活性，即直接损害SARS-CoV-2的S1蛋白与人ACE2受体之间的相互作用。使用明确的无细胞系统和重组S1蛋白，研究表明在临床相关的血浆浓度下，ASA处理会损害S1–ACE2结合，且不依赖于细胞代谢或酶加工过程。该实验设置还使研究人员能够避免ASA对SARS-CoV-2感染期间激活的宿主信号通路（包括NF-κB激活）的额外细胞内影响的混淆。这些观察结果指出了ASA在阻断S1与ACE2相互作用方面的一种独特的、非经典的分子机制，与其已确立的抗炎和抗血栓形成作用分开。
考虑到除了促进病毒进入外，S1与ACE2的结合会触发多种有害信号通路，已知这些通路参与细胞反应，包括炎症、纤维化和组织损伤，共同导致COVID-19的严重程度。因此，阿司匹林干扰S1-ACE2相互作用及随之而来的细胞内信号传导的能力，可能代表了减轻病毒诱导的组织损伤的关键机制。
为了评估ASA诱导的S1-ACE2结合减少是否能有效地转化为有意义的组织保护，研究人员利用了表达人ACE2的转基因小鼠以最大化S1的结合。与之前的发现一致，气管内滴注未经处理的S1会引发显著的组织学肺损伤，重现了COVID-19相关肺损伤的关键病理特征，包括纤维化和炎症。在此背景下，将重组S1蛋白与ASA预孵育足以减轻hACE2-KI小鼠的肺损伤、纤维化和炎症，支持了ASA在调节刺突-受体结合方面先前未被报道的作用。这一点尤其相关，因为在感染期间，相当大比例的患者中发现循环SARS-CoV-2抗原（特别是S1亚基）水平升高，与心肺症状相关，并且在某些情况下在急性后期持续存在，促进了长新冠的病理生理学。研究结果可能表明，ASA抑制循环的SARS-CoV-2或病毒抗原与宿主细胞受体的结合，从而减少表达ACE2的器官中的组织损伤。ACE2的广泛组织分布是严重SARS-CoV-2感染中观察到的器官趋向性和组织特异性损伤的基础，这表明ASA可能通过直接干扰刺突–ACE2结合，在多个易感组织中发挥保护作用。
为了揭示这些观察到的效应的分子基础，研究人员将重点放在蛋白质糖基化上。这种翻译后修饰对SARS-CoV-2尤其相关。事实上，该病毒的S蛋白具有广泛的糖基化，这在正确的蛋白质折叠、与宿主受体的相互作用以及免疫逃逸中起着至关重要的作用。除此之外，ASA已被证明具有抗糖化特性，这提出了一个有趣的可能性，即这种机制是其能够破坏S1蛋白与ACE2结合的基础。为了研究这一假设，研究人员进行了一项全面的糖肽组学分析，比较天然S1蛋白与ASA处理的S1。在实验条件下，在天然S1蛋白中观察到8个被占据的N-连接位点，这个数字低于之前的报告。这些差异可能反映了由刺突蛋白构建体、表达系统和糖蛋白组学工作流程的差异所引入的公认变异性。尽管天然刺突蛋白糖基化存在这些固有的差异，研究数据关键地揭示了ASA处理后S1上特定聚糖结构的丢失。其中，研究人员发现ASA影响了N61和S325的N-和O-连接糖基化，这两个位点先前已被认为是S1–ACE2相互作用的关键调节因子。事实上，N61是一个保守的N-糖基化位点（N-X-S/T基序），在多个结构和糖蛋白组学数据集中一致报道。尽管远离RBD，但N61的N-糖基化靠近弗林蛋白酶切割位点，可能增加切割的空间位阻，这似乎有利于SARS-CoV-2的进入。此外，S325最近被明确确定为RBD内一个意想不到的O-糖基化位点。该残基此后已被多个独立数据集验证，并被提出影响刺突–ACE2结合亲和力。与此一致的是，N-连接和O-连接糖基化的药理学抑制显著损害病毒进入，进一步支持了研究结果，即ASA改变S1糖基化会降低其与ACE2的结合亲和力。
为了直接测试这两个关键残基糖基化的变化是否对刺突蛋白的结合活性有影响，研究人员进行了定点诱变实验，将61位的天冬酰胺（N）残基替换为天冬氨酸（N61D），将325位的丝氨酸（S）残基替换为丙氨酸（S325A），这两种替换都阻止了这些位点的糖基化。在体外，N61残基的单突变负向调节了S1与ACE2的结合活性。研究数据与先前的一项研究一致，该研究表明单N61D突变降低了S1蛋白在细胞表面的结合。增加了另一层复杂性，研究结果提供证据表明，S325处O-聚糖占据的减少与N61D突变协同作用，降低了S1–ACE2结合，从而揭示了一个先前未被报道的刺突-宿主受体相互作用的调节水平。这两个糖基化位点对S1功能特性的生物学相关性通过在hACE2-KI小鼠体内实验得到证实，其中气管内给予N61D/S325A双突变体未能诱导显著的肺泡损伤、纤维化重塑和免疫细胞募集。用突变S1和ASA预处理获得的结果的趋同性加强了这一假设，即要么通过结构方式，要么通过药理学方式干扰S1在ACE2结合界面的糖基化，足以减轻S1在肺组织中的致病活性。
总之，这些发现强调了一种基于糖基化的
