一个罕见的自然SNP通过激活SAME1基因调控茎顶端分生组织大小从而增加甘蓝型油菜分枝数和主花序角果数

《Plant Biotechnology Journal》：Rare Natural SNP Activates SHOOT APICAL MERISTEM ENLARGER1 to Increase Branch Number and Silique Number on the Main Inflorescence in Brassica napus

本研究克隆了一个同时调控甘蓝型油菜分枝数（BN）和主花序角果数（SMI）的主效QTL位点qDB.A09，其因果基因SAME1（SHOOT APICAL MERISTEM ENLARGER1）编码一个MULE转座酶来源的转录因子。研究发现，位于SAME1下游1.4 kb处的一个罕见C-to-A单核苷酸多态性（SNP1055）与其在茎顶端分生组织（SAM）中表达升高相关，通过抑制BnaC06.ARR15表达并扩大BnaA09.WUS表达域，最终导致SAM增大、BN和SMI显著增加，单株产量提升22.05%。该研究为甘蓝型油菜产量性状的遗传改良提供了新的遗传位点。

　　

1 引言

甘蓝型油菜（Brassica napus）是全球重要的油料作物。分枝数（BN）和主花序角果数（SMI）是与产量密切相关的数量性状。提高这些性状可显著增加单株角果总数，进而提升产量。此前，已有研究定位到多个与BN和SMI相关的QTL，但尚未有成功克隆的报道。茎顶端分生组织（SAM）是产生所有地上部分的来源，其大小和形态深刻影响营养分枝和繁殖器官数量。在拟南芥、水稻、番茄和玉米等作物中，已发现多个调控SAM大小的关键基因（如CLV3、WUS等）。本研究旨在克隆调控甘蓝型油菜BN和SMI的主效QTL qDB.A09，并解析其分子机制。

2 结果

2.1 qDB.A09位点通过调控SAM大小影响BN和SMI

通过构建近等基因系（NIL），发现携带db1（稠密分枝1）等位基因的NIL^dd材料，其BN（12.40 ± 1.24）和SMI（124.22 ± 25.57）均极显著高于NIL^DD（BN: 9.00 ± 1.25; SMI: 71.07 ± 15.71），单株种子产量增加22.05%。石蜡切片和扫描电镜分析表明，NIL^dd在幼苗期（5、17、30天）和花过渡期的SAM面积均显著大于NIL^DD，且花过渡期的花序分生组织更大，周围形成更多花分生组织和花原基。

2.2 qDB.A09的图位克隆

利用包含38,010个个体的分离群体，将qDB.A09精细定位到A09染色体上一个7 kb的区间。该区间在ZS11参考基因组中存在一个10,387 bp的插入，仅在db1和NIL^dd中存在，而在T109和NIL^DD中缺失。基因预测和实验验证发现该插入中含有一个新基因，命名为SHOOT APICAL MERISTEM ENLARGER1（SAME1）。其与ZS11的唯一区别是位于基因下游1.4 kb处的一个SNP（SNP1055），在ZS11中为C，在db1和NIL^dd中为A。该SNP与SAME1在SAM中的高表达相关，荧光素酶报告基因实验证实SNP1055为A时能显著增强启动子活性。

2.3 SAME1正向调控甘蓝型油菜的BN和SMI

在NIL^DD中过表达SAME1-SNP1055A构建体（proSAME1:SAME1-SNP1055A），获得的互补株系SAME1-CO#1和SAME1-CO#2的SAM面积、BN、SMI、分枝密度（BD）和主花序角果密度（SD）均显著增加。利用CRISPR/Cas9技术在NIL^dd中敲除SAME1，获得的两个纯合敲除株系SAME1-CR#1和SAME1-CR#2则出现SAM面积减小、BN和SMI显著降低的表型。这些结果证实SAME1是qDB.A09的因果基因，并正向调控BN和SMI。

2.4 SAME1编码一个在SAM中高表达的MULE转座酶来源的转录因子

系统进化分析表明SAME1是十字花科特有的基因，其编码的蛋白包含一个Transposase_mut结构域和一个SWIM锌指结构域，与MULE转座酶衍生的转录因子家族（如FRS和MUSTANG）相似但存在差异。亚细胞定位显示SAME1蛋白定位于细胞核，酵母转录激活实验表明其具有转录激活活性。qRT-PCR和原位杂交显示SAME1在NIL^dd的SAM中特异性高表达，表达区域位于组织中心（organising centre）和中央区（central zone）的边界区域。

2.5 SAME1通过影响BnaA09.WUS的表达来改变SAM大小

RNA-seq分析发现，在SAME1敲除株系中，有953个差异表达基因（DEG）。GO富集分析显示这些基因显著富集于分生组织发育调控等过程。其中，BnaA09.WUS的表达在敲除株系中显著下调，而A型反应调节因子基因如BnaC06.ARR15等则显著上调。原位杂交显示在NIL^dd的SAM中，BnaA09.WUS的表达区域从组织中心扩展至周边区（peripheral zone）和组织中心上层。酵母单杂交（Y1H）、凝胶阻滞实验（EMSA）和荧光素酶报告基因实验证实SAME1能直接结合到BnaC06.ARR15的启动子并抑制其表达。而BnaC06.ARR15又能抑制BnaA09.WUS的启动子活性。这表明SAME1通过抑制BnaC06.ARR15的表达，从而解除对BnaA09.WUS的抑制，最终导致SAM增大。

2.6 利用qDB.A09改良优良品种ZS11的BN和SMI

将qDB.A09位点导入优良品种ZS11，获得改良系ZS11-dd。与ZS11相比，ZS11-dd的SAM面积、BN和SMI均显著增加，证明该位点在育种中具有应用价值。

3 讨论

本研究成功克隆了一个同时调控甘蓝型油菜BN和SMI的主效QTL qDB.A09，其因果基因SAME1是一个MULE转座酶衍生的转录因子。一个罕见的SNP（SNP1055）通过调控SAME1的表达，进而通过BnaC06.ARR15-BnaA09.WUS通路影响SAM大小，最终调控分枝数和角果数。研究为甘蓝型油菜产量性状的遗传改良提供了新的基因资源和理论依据。

4 材料与方法

研究使用了近等基因系、图位克隆、CRISPR/Cas9基因编辑、RNA-seq、qRT-PCR、原位杂交、酵母单杂交、凝胶阻滞实验、荧光素酶报告基因实验等多种分子生物学和遗传学方法对基因功能和调控机制进行了深入解析。