《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Label-free molecularly imprinted polymer–based impedimetric biosensor for rapid detection of
Morganella morganii in real samples
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基于分子印迹聚合物的电化学传感器用于高选择性检测产气荚膜梭菌
Hüseyin O?uzhan Kaya | Yama? Tekinta? | Fatma Kurul | Turku Ac?kgoz | Seda Nur Topkaya
土耳其伊兹密尔Katip Celebi大学药学院分析化学系
摘要
Morganella morganii是一种与新发尿路感染相关的机会性病原体，但目前尚未有用于其快速检测的选择性生物传感平台。在本研究中，我们开发了一种基于分子印迹聚合物（MIP）的电化学生物传感器，专门针对M. morganii设计，实现了无标记、高选择性和低成本的检测。该传感器通过在铅笔石墨电极上存在整个细菌的情况下电聚合苯酚制备而成，随后去除模板以生成特定的识别腔。通过电化学阻抗谱和循环伏安法验证了成功的印迹和选择性再结合。
该生物传感器在真实尿液中的检测限（LOD）为3.0 CFU/mL，线性度（R2）为0.99，重复性（RSD）小于10%，证实了其出色的分析性能。值得注意的是，该传感器在复杂的尿液基质中仍保持高灵敏度，表明其具有很强的基质耐受性。选择性研究表明，其对E. coli、K. pneumoniae、S. aureus和E. faecalis的印迹因子分别为4.5–10.1，证明了其优异的区分能力。该生物传感器的初始响应在3天内保持了95%以上，在14天后仍保持约56%，显示出良好的稳定性。
与传统微生物学和分子检测方法相比，这种基于MIP的平台为尿路感染诊断中M. morganii的早期检测提供了一种快速且无标记的策略。
引言
Morganella morganii是一种革兰氏阴性、兼性厌氧、可移动的肠杆菌科细菌。它是人类和动物正常肠道菌群的一部分，但在免疫系统受损的个体中可能成为机会性病原体[1]。它氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、尿素酶阳性，在MacConkey琼脂上通常乳糖阴性，并由于产生AmpC β-内酰胺酶而对氨苄西林和第一代头孢菌素具有天然抗性[2]。M. morganii可引起多种感染，尤其是尿路感染，还可能导致伤口感染、菌血症，偶尔还会引起新生儿脑膜炎，并表达尿素酶、内毒素、蛋白酶和生物膜形成等关键毒力因子[3]。诊断通常涉及在MacConkey或血液琼脂等培养基上进行培养，必要时使用分子方法进行鉴定（如VITEK 2、API、BD Phoenix）。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）能够快速进行物种水平鉴定，并通过β-内酰胺酶活性分析检测抗菌素耐药性。治疗依赖于抗菌药物敏感性测试，因为多重耐药和产生碳青霉烯酶的菌株越来越普遍[4]。分子方法包括物种特异性PCR、16S rRNA基因测序以确认身份，以及多基因位点序列分型（MLST）或全基因组测序（WGS）以实现高分辨率区分。此外，针对M. morganii脂蛋白抗原的间接ELISA和优化的直接PCR等新方法可以在无需DNA提取的情况下实现临床和环境样本的快速灵敏检测[5]。尽管这些传统和分子诊断技术应用广泛，但它们存在明显局限性：基于培养的鉴定方法耗时较长，通常需要24–72小时才能得出明确结果，且对于生长缓慢或受压的细胞可能产生假阴性[6]。尽管优化的PCR和I-ELISA等方法有所改进，但仍需要实验室仪器和训练有素的人员，并可能受到复杂样本基质的干扰，限制了其在现场的适用性[7]。此外，血清分型和全基因组测序虽然具有高流行病学分辨率，但成本高昂、劳动强度大，不适合快速即时诊断[8]。
除了传统的微生物学和分子方法外，生物传感器技术的最新进展带来了快速、灵敏且便携的病原体检测平台。其中，基于分子印迹聚合物（MIP）的电化学生物传感器提供了模拟抗体-抗原相互作用的合成识别位点，具有高灵敏度和选择性，同时保持成本效益、化学稳定性、可重复使用性，并适用于简单的样本制备[9]。MIP是在目标分子（模板）存在下形成的合成识别材料，去除模板后会留下形状、大小和功能基团互补的特定腔。
相比之下，非印迹聚合物（NIP）在相同条件下制备，但没有模板，因此缺乏这些选择性结合位点，用作评估MIP选择性的对照。通过比较MIP和NIP，研究人员可以验证印迹效果在选择性、结合能力和分析性能方面的表现。在传染病诊断中，电化学MIP传感器能够快速、低成本且选择性地检测病原体或生物标志物，显示出集成到便携式即时诊断平台中的巨大潜力[10]。
尽管在针对Escherichia coli、Salmonella Typhimurium和Proteus mirabilis等病原体的电化学MIP传感器方面取得了显著进展，但目前尚未有针对M. morganii的基于MIP的生物传感器。这一空白可能源于印迹该病原体的挑战，包括其相对较大的细胞尺寸、强烈的表面疏水性、生物膜形成以及富含脂多糖和菌毛结构的外膜，这些因素都阻碍了均匀的模板去除和腔体保存。为了解决这些问题，我们优化了基于苯酚的电聚合过程，形成了在印迹和模板去除过程中保持细菌形态的均匀稳定聚合物层。由此产生的印迹腔准确复制了M. morganii的表面拓扑结构，即使在复杂基质（如真实尿液）中也能实现高度选择性的再结合。M. morganii的选择是因为其在尿路和系统感染中的重要作用以及多重耐药、产生碳青霉烯酶菌株的出现。然而，目前尚无快速、低成本或即时诊断工具可用于其检测。在这里，我们首次开发了一种专门针对M. morganii的分子印迹电化学生物传感器，实现了无标记和高选择性的检测，且所需仪器最少。通过将全细胞MIP技术扩展到这种临床重要但此前被忽视的病原体，我们的工作填补了一个重要的诊断空白，并扩展了基于MIP的传感平台的适用范围。该生物传感器实现了低检测限（PBS中3.2 CFU/mL，人工尿液中1.9 CFU/mL，真实尿液中3.0 CFU/mL），出色的线性度，高印迹因子，以及对相关革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的极低交叉反应性。此外，它还表现出强烈的稳定性（3天内响应率超过95%）和良好的重复性。与传统基于培养或分子的方法相比，该平台提供了一种快速、成本效益高且操作简单的检测方法，能够在真实尿液中实现准确检测，突显了其在即时临床诊断中的潜力。
化学试剂
实验中使用的化学试剂来自多个供应商。PBS片剂、肌酐和白蛋白购自Sigma-Aldrich。氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、六氰合铁(II)酸钾三水合物（K?[Fe(CN)?]）、六氰合铁(III)酸钾（K?[Fe(CN)?]）、甘油脑心输液（G-BHI）和胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）购自Merck。氯化钾（KCl）来自PanReac，而纯乙醇（C?H?OH 99.9%）和苯酚
电化学传感界面的制备
在分子印迹之前，通过循环伏安法（CV）在PGE表面上沉积了多酚薄膜，形成了稳定的电活性聚合物界面，为后续印迹提供了便利。为了验证薄膜形成的成功，对经过多酚改性的电极和裸电极进行了比较电化学表征。这些分析使用2.5 mM K?/4[Fe(CN)?]和0.1 mM KCl溶液中的CV和EIS作为氧化还原探针进行。
1A展示了逐步过程
结论
在这项研究中，我们开发了一种基于MIP的高灵敏度和选择性的电化学生物传感器，用于检测与尿路感染相关的临床重要病原体M. morganii。使用苯酚作为功能单体和整个细菌模板，在铅笔石墨电极上电聚合形成了坚固的MIP层。该生物传感器实现了超低检测限（PBS中3.2 CFU/mL，人工尿液中1.9 CFU/mL，真实尿液中3.0 CFU/mL），优于许多现有方法
CRediT作者贡献声明
Hüseyin O?uzhan Kaya：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。
Yama? Tekinta?：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。
Fatma Kurul：撰写——原始草稿、研究、数据分析。
Turku Ac?kgoz：验证、研究、数据分析。
Seda Nur Topkaya：撰写——原始草稿、验证、监督、资源提供。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）2209-A项目（项目编号：1919B012409117）的支持。
