《Phytomedicine》：Huangqi Chifeng decoction alleviates cerebral ischemia and reperfusion injury by targeting NFKBIA, NF-κB1 p105 and PIAS1 to multi-dimensionally inhibit NF-κB/NLRP3 signaling: A multi-omics analysis
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黄芪柴峰汤通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路减轻脑缺血再灌注损伤并改善神经功能。
陈晓敏|马晓军|唐夏琳|林文毅|郑云辉|詹杰|丁彦兵
中国湖北省中医院神经科，湖北中医药大学附属医院，武汉，湖北。
摘要
背景
:脑缺血-再灌注（I/R）损伤仍然是缺血性中风管理中的一个关键挑战，治疗选择有限。黄芪赤峰汤（HQCF）是一种经典的中药配方，在中风治疗中显示出临床疗效，但其保护机制仍不甚明了。
目的
:本研究旨在评估HQCF对小鼠脑I/R损伤的保护作用，并揭示其潜在的分子机制。
方法
:通过使用小鼠中脑动脉阻塞-再灌注（MCAO/R）模型，通过神经行为测试、TTC染色、H&E染色和Nissl染色来评估HQCF对脑I/R损伤的治疗效果。随后，使用Q-Orbitrap LC-MS/MS进行成分分析。接着，通过蛋白质组学、转录组学和代谢组学等多组学方法来阐明HQCF的治疗机制。通过Western blot、分子对接、细胞热位移测定（CETSA）和免疫荧光验证关键通路和靶点。
结果
:与阳性对照药物依达拉酮相比，HQCF干预显著减轻了MCAO/R小鼠的神经缺陷并减少了梗死体积，同时组织病理学特征也有所改善。综合多组学分析表明，HQCF通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路来减轻I/R损伤，NF-κB抑制剂α（NFKBIA）、PIAS1和NF-κB1 p105是HQCF的关键潜在靶点。LC-MS/MS、分子对接和CETSA研究证实，奥利兰酸、黄芪甲苷A和福尔莫诺内丁分别作用于NFKBIA、PIAS1和NF-κB1 p105，这些靶点在介导HQCF的神经保护作用中起关键作用。机制上，HQCF促进了NFKBIA、PIAS1和NF-κB1 p105对NF-κB激活的抑制，从而抑制了NLRP3/GSDMD驱动的焦亡，最终减轻了梗死区域的神经元损伤。此外，体内实验显示NF-κB激活剂2逆转了HQCF对脑I/R损伤的保护作用。
结论
:本研究系统地证明了HQCF通过多维度抑制NF-κB/NLRP3信号通路介导的神经元焦亡来减轻脑I/R损伤，包括靶向前体NF-κB1 p105、细胞质中的NFKBIA以及核内的PIAS1。这些发现为HQCF治疗脑I/R损伤的机制提供了新的见解，进一步证实了中医通过多靶点策略治疗脑血管疾病的优势，并推动了HQCF的转化研究。
引言
缺血性中风是全球死亡和残疾的主要原因之一，其特征是脑血流突然中断，导致神经元死亡和随后的神经功能缺损（Shu等人，2025年）。由于其高发病率，缺血性中风不仅造成即时的身体损伤，还因其慢性后果带来重大的社会经济负担（Al-Salihi等人，2024年）。目前的治疗方法（如溶栓治疗和血管内血栓切除术）优先考虑快速再血管化（Cuadra-Campos等人，2024年）。然而，这些干预不可避免地会引发脑缺血-再灌注（I/R）损伤，这是一种复杂的病理生理过程，其特征是神经元焦亡、细胞凋亡和炎症，这些因素共同加剧了临床后果（Duan等人，2025年；Zhang等人，2024a年）。尽管进行了大量研究，但仍然迫切需要有效的脑I/R损伤治疗策略。
越来越多的研究表明，炎症在脑I/R损伤中起着重要作用，导致细胞凋亡、血脑屏障破坏、脑水肿和出血性转化（Jurcau & Simion 2021年；Yang等人，2022年）。核因子κB（NF-κB）是炎症诱导损伤的核心，它通过控制许多促炎基因（TNF-α、IL-1、IL-6）和促凋亡基因的表达，并促进NLRP3炎性小体的形成来触发焦亡（Li等人，2024年；Tan等人，2019年；Wang等人，2022年）。NF-κB由两个亚基p50和p65组成。在其非活性形式下，NF-κB与NF-κB抑制剂α（NFKBIA，也称为IκBα）结合并滞留在细胞质中（Paciolla等人，2011年）。在脑I/R损伤中，NFKBIA被IKK激酶复合体磷酸化，从NF-κB中释放出来并被泛素化以进行蛋白酶体降解，从而解除对p65的抑制（Li等人，2022a年）。此外，NF-κB还通过NF-κB1 p105滞留在细胞质中，NF-κB1 p105是NF-κB p50亚基的前体，具有IκB样抑制作用（Orian等人，2000年）。在刺激下，p105被IKK复合体磷酸化，随后通过泛素依赖性蛋白水解被降解，最终促进NF-κB的激活（Collins等人，2016年）。激活的NF-κB转移到细胞核中，与特定DNA序列结合以促进促炎基因的转录（Capece等人，2022年）。有趣的是，Twist-2和PIAS1（STAT-1的蛋白质抑制剂）已被发现通过直接与p65相互作用来抑制NF-κB，从而阻断p65的DNA结合活性（Liu等人，2005年；Sosic等人，2003年）。因此，适当调节NF-κB的激活对于维持大脑稳态至关重要。迄今为止，NF-κB抑制已被广泛证明是治疗脑I/R损伤的潜在策略，例如Plumbagin（Sandur等人，2006年）、Dexmedetomidine（Wang等人，2017年）、Edaravone dexborneol（Shen等人，2024年）等。
中医提供了一种整体的、多靶点的策略，通过系统调节病理生理网络来管理复杂的脑血管疾病（Li等人，2022b；Zheng等人，2024年）。在中药配方中，黄芪赤峰汤（HQCF）源自清代王清仁的《医林改错》，已在脑血管疾病中显示出治疗潜力（中国药典委员会，2020年）。该配方包含黄芪、赤芍和防风，传统上用于增强元气、促进血液循环和消除瘀血（Gu等人，2020年）。临床前证据表明，HQCF通过FXR信号通路调节肠道微生物群-胆汁酸稳态来改善动脉粥样硬化（Fu等人，2023年），并通过抑制TXN/xCT/GPX4信号通路介导的铁死亡来防止平滑肌细胞泡沫形成（Fu等人，2025年）。此外，实验性中风研究表明，它通过抑制神经炎症和氧化应激来发挥神经保护作用，从而改善神经功能（Fu等人，2023年；Wang等人，2021年）。尽管具有这些治疗益处，但HQCF对脑I/R损伤的保护机制仍不明确。
多组学技术（转录组学、蛋白质组学和代谢组学）的整合已成为现代生物医学研究的基石，能够全面解析疾病机制和治疗反应（Fang等人，2024年）。具体来说，转录组学提供了全基因组范围内的基因表达模式动态，蛋白质组学阐明了蛋白质丰度和功能网络，而代谢组学则分析了内源性代谢变化并识别了特定通路的生物标志物（Xu等人，2019年）。组学数据与分子对接分析的结合不仅揭示了中药配方的复杂机制，还通过分子证据验证了中医应用的合理性，现在构成了揭示中医在治疗疾病中的多方面药理作用的强大框架。
在本研究中，我们在小鼠中脑动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型中结合了蛋白质组学、转录组学和代谢组学进行了综合多组学分析。这种系统级方法能够全面阐明HQCF的分子机制，将传统中医应用与现代机制见解相结合，为其在脑I/R损伤管理中的临床转化奠定科学基础。
部分内容
药物和试剂
HQCF粉末为颗粒形式（由江阴天江制药有限公司制备），其配方依据清代医师王清仁在其著作《医林改错》中记录的比例配制，成分包括黄芪60克、川芎3克和防风3克。这些药物来自湖北省中医院，生产批号为2403065301、2311238301和2404104301。
HQCF减轻小鼠的脑I/R损伤
图1A展示了在MCAO/R模型中评估HQCF神经保护效果的实验设计。如图1所示，MCAO/R组表现出明显的神经缺陷和显著增加的脑梗死体积，而HQCF的给药剂量依赖性地减轻了I/R引起的神经功能障碍和脑梗死。值得注意的是，高剂量的HQCF（HQCF-H）表现出与依达拉酮相当的神经保护效果。
讨论
脑I/R损伤仍然是中风后恢复的关键挑战，因为目前用于治疗再灌注相关并发症的策略仍然不足（Zhang等人，2024a）。中医因其神经保护潜力而重新受到关注，HQCF作为脑血管疾病管理的有希望的候选药物（Liang等人，2017年）。在本研究中，HQCF的给药显著减轻了神经缺陷，减少了梗死体积。
结论
本研究证实，HQCF干预能有效减少脑I/R损伤的梗死体积并改善神经功能评分。在机制上，HQCF至少部分通过多维度抑制NF-κB/NLRP3信号通路来保护脑组织，NFKBIA、PIAS1和NF-κB1 P105是关键靶蛋白。这些发现部分揭示了HQCF的神经保护机制，并为HQCF在脑I/R损伤中的临床应用提供了新的前景。
CRediT作者贡献声明
陈晓敏：方法学、研究、数据分析及初稿撰写。马晓军：方法学、研究、数据分析及初稿撰写。唐夏琳：方法学、研究、数据分析及初稿撰写。林文毅：研究及数据分析。郑云辉：研究及数据分析。
詹杰：概念构思、监督、数据分析及审稿编辑。丁彦兵：
数据可用性声明
本研究使用或分析的数据集可应要求向相应作者索取。
CRediT作者贡献声明
陈晓敏：初稿撰写、方法学、研究、数据分析。马晓军：初稿撰写、方法学、研究、数据分析。唐夏琳：初稿撰写、方法学、研究、数据分析。林文毅：研究及数据分析。郑云辉：研究及数据分析。詹杰：初稿撰写、监督、数据分析、概念构思。丁彦兵：审稿编辑、监督、方法学。致谢
本研究得到了湖北省中医药管理局的资助，用于省级中医药创新团队项目（ZY2025L001）、湖北省自然科学基金青年项目（2022CFB923）和湖北省中医药管理局青年项目（ZY2023Q001）。
