拟南芥发育过程中伴随阴离子调控镉毒性变化的蛋白质组学分析

《Plant, Cell & Environment》：Proteomic Analysis Reveals Accompanying Anion-Dependent Changes of Cadmium Toxicity During Arabidopsis thaliana Development

本文通过蛋白质组学分析揭示了在拟南芥（Arabidopsis thaliana）发育过程中，伴随阴离子（SO42?与Cl?）对镉（Cd）毒性效应的调控作用。研究发现，与CdCl2相比，CdSO4处理导致幼苗根长显著缩短、镉吸收增加、地上部镉积累升高，并显著下调微管组织和初生细胞壁合成相关蛋白。这些结果强调了在重金属毒性研究中，伴随阴离子的关键作用常被忽视，对实验室重金属胁迫实验设计具有重要启示。

　　

1 引言

镉（Cd）是一种重要的环境污染物，对生物体具有广泛的 detrimental 效应，因此成为实验室研究的常见对象。然而，在培养基中添加镉盐时，通常使用不同类型的镉盐，如CdCl₂、CdSO₄或Cd(NO₃)₂，而往往忽略了伴随阴离子可能对金属阳离子效应产生影响的可能性。先前的研究表明，不同的镉盐类型可能对植物产生不同的生理和代谢影响。例如，在超积累植物Noccaea praecox中，CdCl₂处理导致镉优先螯合到叶肉细胞的液泡中，而CdSO₄处理则使更多镉结合在细胞壁中。此外，阴离子如Cl^?和SO₄^2?的添加会显著改变培养基的组成，进而影响镉的植物有效性和吸收转运。例如，Cl^?的存在可能通过形成CdCl⁺复合物来增强镉的扩散和吸收，而SO₄^2?的影响则表现出物种特异性。本研究的初步实验发现，在含有两种不同镉盐的培养基上，7天龄的拟南芥幼苗在根形态上存在差异：暴露于50 μM CdSO₄的幼苗根长明显短于CdCl₂处理的幼苗。因此，本研究旨在阐明CdSO₄和CdCl₂盐对拟南芥发育的不同影响。

2 材料与方法

2.1 植物材料与生长条件

拟南芥（Arabidopsis thaliana）的种子（生态型Columbia-0、Landsberg erecta和Wassilewskija）来自英国诺丁汉拟南芥种质资源中心。种子经乙醇表面消毒后，播种于含有0.8%植物琼脂的1/2强度Murashige和Skoog（MS）培养基上，在短日照条件下（8小时光照，100 μmol m^?2s^?1，21°C；16小时黑暗，19°C）培养7天。培养基通过添加0.1 M的CdCl₂或CdSO₄储备液，使最终浓度分别为4 μM或50 μM。为了平衡阴离子效应，在CdCl₂处理中添加K₂SO₄，在CdSO₄处理中添加KCl进行补偿。幼苗整体或分为根和地上部收集，并于-80°C保存。

2.2 根长测量

幼苗拍照后，使用RootDetection软件分析根长。像素长度通过照片中的定义尺度转换为毫米。统计分析采用Kruskal-Wallis检验及事后Dunn检验（Bonferroni校正，p < 0.05）。

2.3 拟南芥幼苗的蛋白质组学分析

蛋白质提取和溶解使用热SDT缓冲液（4% SDS、100 mM DTT、100 mM Tris-HCl，pH 7.6）和玻璃珠，涡旋30秒，95°C孵育1小时。蛋白质混合物通过滤膜辅助样品制备（FASP）方法处理，包括还原、烷基化和胰蛋白酶消化。肽段混合物通过nanoElute系统联用timsTOF Pro进行LC-MS/MS分析。数据使用MaxQuant软件处理，搜索UniProt拟南芥蛋白质组数据库。缺失值通过R包imp4p进行插补，组间比较采用limma包进行配对调节t检验（BH校正，p < 0.05）。PCA分析和GO富集分析分别使用FactoMineR和g:Profiler完成。

2.4 金属含量测量

新鲜组织（25 mg）经trace metal grade HNO₃矿化4天后，用去离子水稀释至5% HNO₃，通过ICP-MS测量金属含量（包括¹¹¹Cd）。统计分析采用对齐秩变换方差分析（ART ANOVA）及事后检验（FDR校正，p < 0.05）。

3 结果与讨论

3.1 硫酸根作为伴随阴离子在高镉暴露下比氯离子引起更强的拟南芥根生长抑制

为验证CdSO₄对根发育的抑制效应强于CdCl₂的假设，我们在相对较低（4 μM）和较高（50 μM）的镉盐浓度下培养了三种不同的拟南芥生态型，并评估了根长。Ws生态型在低镉胁迫下就显示出镉盐处理间的根长差异，而其他两种生态型则无此效应。低浓度CdSO₄胁迫促进了Col生态型的根生长，而两种镉盐在低浓度下均抑制了Ler生态型的根生长。高镉处理在所有三种生态型中均 adverse 影响根生长，且CdSO₄的抑制效应显著更强。1/2强度MS培养基中含有2.99 mM Cl^–和0.815 mM SO₄^2–，添加50 μM CdCl₂使Cl^–含量增加3.34%，添加50 μM CdSO₄使SO₄^2–含量增加6.13%。尽管这些增量看似较小，但通过添加KCl或K₂SO₄补偿阴离子浓度并未消除观察到的差异，表明变化可能与镉盐在MS培养基中的形态有关，进而影响镉的植物有效性和吸收转运。在烟草（Nicotiana tabacum）中的实验显示，高镉处理对根生长的抑制较温和，且未检测到镉盐类型的影响，表明镉盐的不同效应在植物中并非普遍存在。

3.2 CdSO₄处理对拟南芥蛋白质组的影响比氯化物盐更 detrimental

蛋白质组学分析显示，地上部组织提取物在镉盐处理间无显著差异。而对拟南芥Col生态型幼苗根部提取物的分析共鉴定到5976种蛋白质，定量了5442种蛋白质。与对照组相比，镉处理中有1111种蛋白质的丰度存在差异。主成分分析（PCA）显示，前两个成分解释了70.3%的变异，并将蛋白质组明显分为对照组、CdCl₂组和CdSO₄组。CdSO₄处理对植物蛋白质组的影响更大，Venn图显示，与CdCl₂处理相比，CdSO₄处理中上调的蛋白质（79种）主要与对不同刺激的响应相关，而下调的蛋白质（23种）则影响次生代谢物合成途径，包括硫代葡萄糖苷（GLS）生物合成和类黄酮生物合成。具体而言，CdSO₄处理特异性上调的蛋白质中，至少有10种与过氧化物酶体相关，包括过氧化氢酶（CAT1）和 glycolate oxidase（GOX1和GOX3），这些蛋白质参与活性氧（ROS）代谢和光呼吸。这些变化表明，CdSO₄处理引起了更高的应激反应。

3.3 蛋白质组数据指向纤维素生物合成抑制是CdSO₄更强镉毒性响应的因素

对CdSO₄处理特异性下调（相对于对照组）且与CdCl₂处理差异显著的蛋白质（100种）的分析提供了更深入的见解。一个蛋白质簇表明初生细胞壁合成受到抑制，特别是与初生细胞壁纤维素沉积相关的纤维素合酶（CESA）复合体组分（CESA1、CESA6和CESA3/CEV1）的丰度降低。同样，glycosyl hydrolase 9A1（GH9A1/KOR1）和CESA interactive protein 1（CSI1）也下调。这些蛋白质与微管组织密切相关，其功能紊乱可能是根生长抑制的原因之一。此外，GO和UniProt关键词富集分析显示，CdSO₄处理负调控甾醇和脂质生物合成，以及L-岩藻糖生物合成。GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶1（GMD1）和GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶-4-还原酶1（GER1/FX）的丰度显著降低，而岩藻糖基化抑制先前已被报道可抑制根伸长。另一个簇中包含至少六种与核糖体生物发生相关的蛋白质，其丰度下降，表明蛋白质合成机制受到影响。这些变化可能是对CdSO₄处理下更强镉胁迫的响应，也可能与镉的空间分布差异有关。

3.4 硫酸根作为伴随阴离子增强镉的植物吸收和地上部积累

为探究表型和蛋白质组变化是否源于镉吸收的差异，我们分析了处理植物的离子组。暴露于CdSO₄的植物在地上部和整体幼苗中的镉浓度均高于CdCl₂处理，而根中的镉水平无差异。整体幼苗中镉水平的升高表明硫酸盐处理增强了镉的吸收，这种更高的吸收导致镉在地上部积累。根中镉滞留的缺乏表明防御机制失调，这些机制通常有助于螯合镉，从而减少根向地上部的转运。这种现象可能与细胞壁镉结合能力的变化、镉的螯合（如植物螯合肽PCs）或液泡区室化等有关。 regardless of the type of Cd salt, 镉处理导致整体幼苗和根中Mn、Zn和Fe水平降低，而地上部Zn含量也下降。这些变化与镉吸收和转运依赖其他金属（如Fe、Mn或Zn）的转运蛋白一致。相比之下，Mo水平在整体幼苗中升高。尽管镉盐处理间镉水平存在差异，但其他金属的浓度保持不变，表明7天暴露期可能不足以检测到由相对高剂量镉盐诱导的细微离子组变化。

4 结论

本研究证明，与CdCl₂相比，CdSO₄处理更显著地抑制拟南芥根发育，并导致更高的镉吸收和地上部分配。这些效应与SO₄^2?或Cl^?浓度无关，因为补充这些离子并未缓解根生长抑制。蛋白质组学分析表明，CdSO₄对蛋白质组的影响更为深远，特别影响了微管组织和初生细胞壁合成相关的蛋白质。这些变化可能是对CdSO₄处理下更强镉毒性的响应，并与Cd²⁺与阴离子形成复合物及其被根吸收的能力有关。总之，本研究强调了在 cationic pollutants 毒性研究中，伴随阴离子的关键作用常被忽视，这对利用高剂量化学物质诱导重金属胁迫响应的短期研究设计具有重要意义。