综述：植物发育中活性氧产生与清除的关联

《Plant, Cell & Environment》：Linking Superoxide Production and Scavenging in Plant Development

本文系统综述了植物发育过程中超氧阴离子（O2•-）的产生（主要由NADPH氧化酶RBOHs介导）与清除（主要由超氧化物歧化酶SODs负责）之间的协同调控机制。文章重点阐述了生长素（Auxin）和脱落酸（ABA）信号通路如何通过调控RBOHs和SODs的表达与活性，从而精确控制活性氧（ROS）的时空分布，进而影响根系发育、花粉管生长、种子萌发等多种发育过程。作者还探讨了二者在转录水平、蛋白质翻译后修饰（PTMs）及蛋白质-蛋白质相互作用层面的潜在协同机制，为理解ROS信号网络在植物发育中的核心作用提供了新视角。

　　

2 超氧化物依赖性机制调控植物发育

活性氧（ROS），特别是超氧阴离子（O₂^•-）及其相关的氧化还原机制，在植物最佳条件和胁迫条件下的正常生长中扮演着关键角色。它们精确调控细胞周期、增殖、扩张和极性等过程。O₂^•-的水平是其产生和清除机制共同作用的结果，其发育功能不仅取决于其数量，还取决于其在细胞和组织内的空间分布和定位。

发育受到O₂^•-与过氧化氢（H₂O₂）浓度比例的影响，因为它们在分裂细胞和分化细胞中表现出拮抗效应和独特的组织特异性模式。例如，在花粉发育过程中绒毡层的程序性细胞死亡（PCD）、根冠发育或胚乳发育都需要O₂^•-和H₂O₂的同步时空分布。

ROS主要通过氧化修饰关键调控蛋白来调节细胞周期、细胞生长、分化、细胞命运决定和整体植物发育，这些蛋白包括转录因子（TF）、受体、参与植物激素信号和代谢的蛋白、细胞骨架成分和细胞骨架结合蛋白。由于O₂^•-的氧化能力有限，其对氧化修饰的影响是间接的，主要作为H₂O₂和羟基自由基（·OH）的前体。例如，由RBOH介导的O₂^•-/H₂O₂产生对于干旱分枝过程中的IAA3氧化至关重要。由O₂^•-产生的H₂O₂也可以通过氧化膜磷脂改变细胞膜的生物物理特性，从而影响膜的流动性和功能。

植物发育还通过ROS与植物激素（如生长素和ABA）的相互作用进行调控。ROS可以影响生长素水平，破坏其极性运输和分布，或影响生长素信号传导。O₂^•-的形成也与ABA调控的主根生长有关。ABA还可能通过线粒体DEXH RNA解旋酶ABA-OVERLY SENSITIVE 6 (ABO6) 和 ABO8触发线粒体O₂^•-的产生，以通过调节根分生组织活性和种子萌发来抑制主根生长。

3 发育过程中RBOHs对O₂^•-产生的调控

质膜RBOHs通过将电子从NADPH转移到O₂，催化质外体中O₂^•-的生成。随后，它通过SODs酶促、通过抗氧化剂（如生育酚和抗坏血酸）或通过自发歧化（仅在低pH值下有效）被歧化为H₂O₂。拟南芥基因组包含十个RBOHs，它们在各种器官、组织和发育阶段中差异性表达，主要通过产生O₂^•-及其随后歧化为H₂O₂来发挥作用。

RBOHs在转录、转录后和翻译水平上受到调控，其激活则由蛋白质翻译后修饰（PTMs，主要是磷酸化）以及Ca²⁺结合介导。它们也可能受到磷脂酸和蛋白质-蛋白质相互作用的调节。RBOHs还通过选择性剪接受到控制。例如，AtRBOHB以两种剪接变体的形式表达，其在组织和发育特异性表达上有所不同。

生长素和ABA在发育过程中通过中间信使（包括转录因子、Ca²⁺、蛋白激酶和磷脂）的层级结构来调节RBOHs。RBOHs的表达可能由生长素响应因子（ARFs）触发。类似地，一些拟南芥RBOH亚型含有ABA响应元件（ABREs），表明它们受ABA的转录调控。

生长素和RBOHs之间的相互作用在根发育中得到了最显著的例证。在初生根中，拟南芥RBOHC的点敲低突变体显示根冠和柱状区域的O₂^•-产生减少，这与生长素水平降低相关，导致表型缺陷，表现为比野生型更短更粗的初生根和减少的侧根数量。在根毛形成过程中，RBOHC介导的O₂^•-产生受到FERONIA受体样激酶（FER）-ROP2模块的促进。

与生长素类似，ABA也可以通过RBOHs的活性诱导O₂^•-的产生。具体来说，ABA通过调节拟南芥中的AtRBOHD和AtRBOHF来抑制根伸长。主根生长也受MADS-BOX转录因子25 (MADS25) 的调控，其表达被ABA抑制。MADS25通过调节AtRBOHF和AtRBOHG的表达来微调伸长区的O₂^•-水平，从而影响主根伸长和侧根密度。

除了根以外，RBOH和RBOH产生的O₂^•-在生殖中也发挥作用。拟南芥rbohe突变体显示花粉数量减少和花粉畸形，表明其参与花粉发育。此外，花粉管生长和受精涉及RBOHH和J的合作。

生长素和ABA以协同的方式在发育调控网络中发挥作用。这种相互作用通常通过生长素和ABA响应转录因子的相互作用来介导。生长素信号传导促进ABA信号传导，通过诱导ARF10和ARF16介导的ABI3激活来刺激ABA信号传导，从而增强种子休眠和抑制种子萌发。ABA和生长素的相互作用也与主根的生长和向性有关。在这里，ABA通过减少PIN2的膜丰度来抑制向顶端的生长素运输，导致主根生长速率降低、向重力性被破坏以及生长素分布异常。

4 SODs的调控及其在发育过程中的作用

SODs对O₂^•-的清除伴随着H₂O₂的产生，H₂O₂随后被过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸-谷胱甘肽循环、过氧化还原蛋白、谷氧还蛋白和硫氧还蛋白进一步分解。O₂^•-也可能被抗坏血酸非酶促清除，或通过其与H₂O₂（在Haber-Weiss反应中）、一氧化氮（NO）或硫化氢（H₂S）的反应来清除。然而，最有效的清除剂是SODs和抗坏血酸。

SODs是特定的酶促抗氧化剂，因为它们维持O₂^•-和H₂O₂之间的细胞平衡。它们的催化活性必须被精确调控，以将O₂^•-和H₂O₂浓度维持在生理水平并确保其信号功能。SOD的活性需要其活性位点有一个金属离子；在植物中，这包括铁（用于FeSOD）、铜和锌（用于Cu/ZnSOD）以及锰（用于MnSOD）。每种同工酶由几种具有特定定位和表达特征的亚型编码。

SODs的表达受发育调控。在拟南芥中，FSD1在所有亚型中表达最高，在种子萌发和早期莲座丛发育期间达到峰值。另一方面，CSD1和CSD2的表达在早期发育阶段较低，并在开花后增加。大多数SOD亚型（除FSD3外）优先在茎顶端分生组织（SAM）的分化外周区表达。这表明特定的发育过程对SOD活性有更高的需求。

SOD突变体表现出不同的发育表型。FSD2和FSD3是独特的叶绿体蛋白，并形成异源多聚体复合物，推测是为了保护叶绿体DNA。单个fsd2和fsd3突变体表现出生长迟缓和叶片淡绿的表型。尽管有明显的发育表达动态，拟南芥fsd1突变体没有表现出明显的发育表型，表明FSD1是条件性必需的。线粒体MSD1可能是主要的调控SOD亚型，因为抑制MSD1的拟南芥反义株系表现出根更短，鲜重更低。另一个MnSOD形式，质外体MSD2，也参与根发育，因为MSD2突变体在黑暗中表现出根生长缺陷，伸长区更长。

尽管拟南芥CSDs主要与胁迫响应相关，它们在发育调控中的潜在作用仍有待探索。烟草Cu/ZnSOD1与花粉管生长有关，因为NtCu/ZnSOD1的反义敲低导致花粉管长度减少。

鉴于不同SOD亚型在生长和发育过程中表达的波动，它们的调控是必不可少的，并且可能发生在多个水平。首先，CSDs和FSD1的表达关键取决于铜和铁的生物利用度。转录因子SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE PROTEIN 7 (SPL7) 是拟南芥铜缺乏响应的核心调控因子。在铜缺乏条件下，SPL7直接诱导FSD1表达，以及miRNA398以下调CSD1、CSD2和铜伴侣（CCS）。因此，这种补偿机制确保了在某些条件下亚型的替换，这在胁迫响应期间尤其重要。

除了SPL7，植物SODs可能受到其他一些转录因子的转录控制。在转录调控的上游是其诱导的必要性，这在发育过程中是由激素信号协调的。植物激素如生长素和ABA可能影响SODs的表达。

5 连接O₂^•-产生与清除的机制

适当的发育程序取决于ROS产生和清除的精确时空控制。在空间上，组织和细胞必须维持特定的ROS分布，同时在需要时允许快速重新定位。适当的ROS水平也必须保持在正确的亚细胞区室中。为了维持极性生长，ROS必须积累在特定的细胞区域，反映它们的极性分布。实现这一点需要ROS产生和清除之间的紧密协调。

到目前为止，只有少数研究报道了在发育过程中同时参与ROS产生和清除的酶。拟南芥茎顶端分生组织（SAM）中的干细胞维持受O₂^•-和H₂O₂空间分布的控制。O₂^•-优先在干细胞中积累，主要通过RBOHD和RBOHF的活性，线粒体ROS也有贡献，并调节WUSCHEL (WUS) 表达。为了维持高O₂^•-水平，大多数SOD亚型的表达被抑制，而O₂^•-可能促进RBOH表达。相反，H₂O₂在分化外周区积累，并可能通过未知机制抑制RBOH活性以控制O₂^•-的产生。

在拟南芥根尖，H₂O₂促进内皮层/皮层原始细胞中的垂周细胞分裂。H₂O₂水平由SHORTROOT通过激活RBOHE和RBOHF来提升。同时，水杨酸信号通路被增强以抑制CAT2表达。高H₂O₂水平可能由FSD1维持，因为它在内皮层/皮层原始细胞中显示最大值。

目前很少关注界定在植物发育过程中整合和同步ROS产生和分解机制的信号和调控机制。下面讨论可能的通过氧化蛋白质翻译后修饰对SODs和RBOHs的激活、RBOHs和SODs的转录共激活以及通过蛋白质-蛋白质相互作用对RBOHs和SODs的共调控。

5.1 氧化PTMs对SOD和RBOHs的调控

SODs可能被RBOH活性间接产生的H₂O₂/·OH介导的氧化PTMs激活或失活。由于RBOHs产生O₂^•-/H₂O₂，它们可以调节细胞氧化还原环境，从而影响蛋白质半胱氨酸残基的反应性，进而可能影响由NO介导的S-亚硝基化。通过这种ROS–NO交互对话，RBOH活性可以调节关键信号蛋白的S-亚硝基化，可能包括SODs，从而微调胁迫响应、防御信号和发育过程。

对拟南芥和水稻SOD亚型氨基酸序列中 redox-active 半胱氨酸的筛选发现，几乎所有AtSOD亚型中都存在众多 redox-active 半胱氨酸。H₂O₂介导的半胱氨酸氧化在叶绿体CSD2的C140上被鉴定。CSD2也可能在C119处发生S-亚硝基化。其他 redox-sensitive 半胱氨酸已在CSD2的C208以及CSD1的C56和C145上被鉴定。由于SODs在所有物种中高度保守，这些Cys残基可能具有重要作用。

从植物PTM查看器获得的结果特别引人入胜，因为它们表明N末端蛋白酶切、N末端乙酰化（NTA）和赖氨酸乙酰化可能是AtSODs中频繁的翻译后修饰。有趣的是，拟南芥FSD1和CSD1的NTA在蛋白质组学研究中被检测到。CSD2、CSD3和MSD1也是这种修饰的候选者。NTA是一种不可逆的共翻译和翻译后修饰，涉及从乙酰辅酶A将乙酰基酶促转移到蛋白质N-α-氨基基团。这种修饰由N末端乙酰转移酶催化，在所有生命领域中都存在。NTA可以调节植物中的蛋白质稳定性、折叠、复合物组装、亚细胞定位和蛋白质-蛋白质相互作用。

关于OsSODs氧化PTMs的实验证据非常有限。最近一项对两个水稻品种的S-亚硝基化蛋白质组学研究鉴定出OsSOD肽段VACGIIGLQG上诱导的S-亚硝基化，而这种PTM显著影响了总SOD活性。相反，植物PTM查看器的结果显示OsSODs存在多种PTMs，包括2-羟基异丁酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、丙二酰化和乙酰化，其中许多在AtSODs中不存在。另一方面，NTA是缺失的，尽管序列比对显示OsSODs的N-α-氨基位置有几个保守的丙氨酸残基。这可能是由于作物物种数据集覆盖范围有限造成的。

RBOHs的各种PTMs的作用和影响已在近期研究中得到全面综述，因此此处不详细描述。总的来说，两种对RBOH活性产生直接影响的氧化PTMs已在植物中得到实验表征：AtRBOHD在Cys890处的S-亚硝基化负调控其活性，以及在Cys825和Cys890处的过硫化增强了AtRBOHD的O₂^•-产生。

这些发现表明，SODs对O₂^•-的清除可能通过基于氧化还原的PTMs与其由RBOH的产生相互关联。考虑到O₂^•-氧化蛋白质底物的能力有限，SODs可能被源自O₂^•-分解的H₂O₂氧化。在这种模型中，O₂^•-清除将作为一种反馈激活机制。然而，这种相互作用取决于两种酶的共享质外体定位和 redox-active 氨基酸残基的存在。因此，这种机制可能是亚型特异性的。

5.2 共享转录因子对SODs和RBOHs表达的共激活

植物激素和肽配体是植物发育过程的关键调控因子，它们可能通过激活转录因子来调节RBOHs以及SODs的表达。转录因子可能同时诱导SOD和RBOH的表达。因此，我们筛选了这些基因的启动子序列以寻找共享的顺式调控元件。应用两个生物信息学数据库PlantCARE和Agris，我们证明了拟南芥中几乎所有RBOH和SOD亚型共有的潜在顺式元件。

TATA-box和CAAT-box基序是生物信息学分析中最常见的顺式元件。它们为RBOHs和SODs所共有。在所选酶的所有启动子序列中出现的另一个基序是保守的ABRE (ACGTGG/TC)。它们被在胁迫条件（如干旱、高盐或低温）下激活的转录因子识别。ABRE元件也是主要的钙调控启动子基序。它们控制响应ABA诱导信号通路的基因表达，该通路受钙信号调控。

ROS的产生和释放取决于一种机制，该机制可能由位于贡献基因区域上游的单个顺式元件的活动组成。这些基序先前被分为两组：常见的ROS相关和ROS特异性顺式元件。RBOHs和SODs中的ROS特异性基序由G-box (CACGTG) 和 W-box (TTGACC) 元件代表。前者在参与激素信号和光响应的基因中频繁出现，而W-box被称为WRKY的转录因子识别，WRKY在生物和非生物胁迫防御中起重要作用。

关于结合到RBOHs和SODs共有的G-box或W-box的特定转录因子的实验证据非常少。研究发现，在过载HbWRKY82的拟南芥植物中，CSD1、CSD2、FSD3和RBOHD的转录水平显著增加。WRKY家族的另一个转录因子，特别是AtWRKY57，在水稻中过表达增加了OsCSD1和OsCSD2的表达水平。过表达KoWRKY40的转基因拟南芥株系表现出MSD1转录水平增加。

G-box结合NAC转录因子NTL4可以通过结合到AtRBOHC和AtRBOHE的启动子序列来调节ROS产生。在烟草植物中，bHLH123通过结合RBOHE基因的G-box元件来控制对抗非生物胁迫条件的防御机制。

最后，MYB和MYC元件出现在RBOHs和SODs启动子中，是被MYB和MYC转录因子识别的基序。这些转录因子是类黄酮生物合成和耐冷性的关键调控因子。

这些结果表明，RBOHs和SODs共享许多顺式元件，这些元件被参与许多生物过程（如发育、对植物激素和环境胁迫条件的响应）的广泛转录因子识别。然而，其他机制，包括转录中介体复合物，也可能在ROS稳态的表达控制中有效。

5.3 蛋白质-蛋白质相互作用

ROS的产生和清除可能通过同时与SOD和RBOH结合的蛋白质在空间和时间上进行协调。实际上，抗氧化酶，特别是SODs，与多种蛋白质相互作用，这些蛋白质介导其激活、稳定或折叠。这些蛋白质对共同参与多种功能，包括离子稳态或逆行信号。

拟南芥SODs的一个相互作用伙伴，更具体地说是FSD1和CSD1，是激活蛋白激酶C受体 (RACK1)，它也被证明能够结合RBOHs。在水稻中，OsRACK1B与RBOHD的N末端相互作用，OsRACK1B过表达导致花粉中H₂O₂积累增加，对其发育产生负面影响。ROS刺激效应也在OsRACK1A上观察到，它在免疫响应期间与RBOHB相互作用。值得注意的是，RACK1A在氧化胁迫下被磷酸化并发生二聚化，这可能触发蛋白质-蛋白质相互作用。RACK1也与异源三聚体G蛋白的亚基相互作用。

另一个可能影响SODs和RBOHs的调控蛋白复合物是G蛋白复合物。根据高通量Y2H结果，FSD1可能也参与G蛋白信号传导，因为它被显示与G蛋白α亚基1 (GPA1)、G蛋白β亚基 (AGB1) 以及β亚基的效应器酸性还原酮双加氧酶2 (ARD2) 相互作用。RACK1A与G蛋白信号调节因子1 (AtRGS1)、AGB1和G蛋白γ亚基1和2 (AGG1/2) 相互作用。RBOHs也通过与G蛋白复合物的蛋白质-蛋白质相互作用受到调控。GPA1，也与SOD相互作用的亚基，在免疫响应期间也与RBOHD相互作用。这意味着G蛋白复合物可能将SODs、RACK和RBOHs聚集在一起，以在发育过程中控制氧化还原稳态。

RACK1A通过与其关键调控蛋白（如BZR1、ABI5和EIN3）的相互作用影响油菜素内酯（BR）、乙烯和ABA信号传导，从而影响下胚轴伸长、种子萌发和萌发后生长以及叶片衰老。在ABA信号传导期间，RACK1A与miRNA加工和效应器复合物的关键组分SERRATE (SE) 和ARGONAUTE 1 (AGO1) 相互作用，包括直接影响CSD表达的miR398的调控。生长素诱导RACK1A在Tyr248上的磷酸化，导致其同源二聚化，促进侧根形成。因此，RACK1A可能响应内源植物激素信号的变化来控制ROS水平。

在哺乳动物中发现了SOD和NADPH氧化酶之间一个有趣的联系。哺乳动物SOD1可能通过直接与Rho GTP酶 Rac1相互作用来调节Nox1 NADPH氧化酶。在还原条件下，SOD与Rac1的结合导致Rac1的GTP水解被抑制。然而，在氧化条件下，SOD1-Rac1复合物解离，允许Rac1进行GTP水解。与肌萎缩侧索硬化相关的SOD1点突变通过激活Rac1/Nox1模块导致O₂^•-过量产生。组成型活性Rac1也对SOD1有影响。尽管植物中也报道了RopGTPases和NADPH氧化酶之间的相互作用，但Rop GTPase – SOD相互作用的功