《Science of The Total Environment》：Molecular biomarkers associated with environmental naphthalene exposure in the respiratory system
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本研究通过转录组分析揭示萘诱导的呼吸道上皮细胞毒性机制，鉴定出11个早期响应基因（ERGs）作为潜在生物标志物，并验证其在小鼠呼吸道组织、灌洗液细胞及体外人细胞系中的特异性表达模式，为环境毒素暴露评估提供新指标。
韩惠贞|阿玛图夫申·巴萨安库|博贡·金|安吉拉·阿斯特里德·塞卡尔·普拉梅斯瓦里|卡琳娜·卡拉尼|保罗·潘扎|尚武·李|吴根·金|尹哲丽|崔哲熙|金贤泰
顺天乡医学生物科学研究所（SIMS），顺天乡大学，全罗南道天安市，31151，韩国
摘要
萘（NPT）是一种多环芳烃（PAH）污染物，存在于烟草烟雾和各种消费品中，导致人类广泛接触毒性物质。NPT引起的细胞毒性依赖于细胞色素P450（CYP）介导的代谢激活步骤，主要影响导气道的非纤毛俱乐部细胞。在这里，我们描述了NPT损伤后气道上皮细胞的组织学特征和基因表达谱，并鉴定了对NPT敏感的早期反应基因（ERGs）。NPT在注射后24小时内导致假复层气道上皮细胞脱落。通过对NPT处理的小鼠肺部进行转录组分析，我们观察到与对外部刺激和化学暴露反应相关的基因在24小时后显著上调。为了鉴定新的化学损伤分子生物标志物，我们选择了11个与这些过程功能相关的候选基因进行进一步研究。这些基因中的大多数在从NPT损伤的小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离出的细胞中上调。此外，选定的ERGs在NPT损伤后的气管和肺中以细胞类型特异性的方式动态上调，其中Vimentin和E-Cadherin分别标记了间充质细胞和上皮细胞对NPT的反应。总体而言，我们的发现表明NPT会诱导细胞毒性并损害气道上皮细胞的黏附性。从呼吸组织、BALF细胞和一个人类气道上皮细胞系中，我们鉴定了可作为环境毒素暴露的潜在分子生物标志物的ERGs。
引言
萘（NPT）是烟草烟雾和各种消费品（包括家用驱虫剂、染料和樟脑丸）中的多环芳烃（PAH）污染物。环境暴露于NPT会导致急性和慢性健康影响，包括呼吸系统和血液系统的病理变化以及癌症（Shimada等人，2016年）。急性暴露于NPT会对多个器官系统造成损伤，特别是呼吸系统、皮肤、胃肠道和血液。另一方面，慢性暴露于NPT会导致白内障、视网膜出血、溶血性贫血以及癌症风险增加（Yost等人，2021年）。
NPT通过细胞色素P450（CYP）单加氧酶催化的代谢激活步骤引起细胞毒性。萘的几种活性代谢物可能对其毒性有贡献，包括1,2-萘氧化物、1,2-萘醌和1,4-萘醌，在实验室动物和人类中都是如此。在小鼠中，NPT会对肺部的假复层上皮细胞（尤其是俱乐部细胞）造成严重的剂量和部位选择性损伤，其中细胞色素P450途径被激活（Plopper等人，1992a；Plopper等人，1992b；Van Winkle等人，1995年）。除了其一般的分泌作用外，俱乐部细胞是细胞色素P450单加氧酶异构体2F2（CYP2F2）的主要细胞定位，这种酶对NPT具有高催化活性，并在小鼠气道中高度存在（Plopper等人，2001年）。因此，俱乐部细胞比气道上皮中的其他细胞类型更容易受到NPT诱导的细胞毒性损伤。
气道上皮细胞是许多病原细菌和病毒以及外部刺激和环境毒素的第一道屏障和反应者。近端呼吸器官的气道上皮由俱乐部细胞、纤毛细胞、基底细胞和杯状细胞以及神经内分泌细胞组成。远端气道上皮由俱乐部细胞、纤毛细胞和神经内分泌细胞组成（Rock和Hogan，2011年；Davis和Wypych，2021年）。这些气道上皮细胞具有多种功能，如物理屏障、免疫反应和细胞因子分泌以及黏液纤毛清除。
据我们所知，动物模型中尚未鉴定或验证NPT暴露及其相关损伤的生物标志物。迄今为止，有两种类型的尿液代谢物——即巯基酸代谢物和萘酚结合物，已被用作NPT暴露的指标。巯基酸在60多年前首次被鉴定为萘的尿液代谢物。在先前的研究中，所有接受NPT处理的物种（包括啮齿动物和人类）都通过尿液产生并排泄这些代谢物（Boyland和Sims，1958年）。此外，萘暴露还会产生几种有用的生物标志物，包括1-羟基萘和2-羟基萘，这些标志物可用于评估全身对PAHs的暴露情况，类似于1-羟基芘的使用方式（Rappaport等人，2004年；Sudakin等人，2013年）。然而，尚未明确鉴定出NPT暴露后对呼吸上皮具体影响的分子生物标志物。
在这里，我们在呼吸器官中鉴定出针对环境毒素（例如萘）的新分子生物标志物。我们使用转录组分析来识别对照组和萘暴露组之间呼吸器官中差异表达的基因，并分离出对萘的早期反应基因（ERGs），以测试它们的时空表达。我们还确认了这些ERGs在呼吸器官、BALF细胞和一个人类气道上皮细胞系中的细胞类型特异性表达，以及它们受到萘的细胞和组织特异性调控。我们的发现表明，这些ERGs可能作为呼吸系统中环境毒素暴露的有用分子生物标志物。
部分摘要
萘（NPT）是烟草烟雾和各种消费品（包括家用驱虫剂、染料和樟脑丸）中的多环芳烃（PAH）污染物。环境暴露于NPT会导致急性和慢性健康影响，包括呼吸系统和血液系统的病理变化以及癌症（Shimada等人，2016年）。急性暴露于NPT会对多个器官系统造成损伤，特别是呼吸系统、皮肤、胃肠道和血液。另一方面，慢性暴露于NPT会导致白内障、视网膜出血、溶血性贫血以及癌症风险增加（Yost等人，2021年）。
NPT通过细胞色素P450（CYP）单加氧酶催化的代谢激活步骤引起细胞毒性。萘的几种活性代谢物可能对其毒性有贡献，包括1,2-萘氧化物、1,2-萘醌和1,4-萘醌，在实验室动物和人类中都是如此。在小鼠中，NPT会对肺部的假复层上皮细胞（尤其是俱乐部细胞）造成严重的剂量和部位选择性损伤，其中细胞色素P450途径被激活（Plopper等人，1992a；Plopper等人，1992b；Van Winkle等人，1995年）。除了其一般的分泌作用外，俱乐部细胞是细胞色素P450单加氧酶异构体2F2（CYP2F2）的主要细胞定位，这种酶对NPT具有高催化活性，并在小鼠气道中高度存在（Plopper等人，2001年）。因此，俱乐部细胞比气道上皮中的其他细胞类型更容易受到NPT诱导的细胞毒性损伤。
气道上皮细胞是许多病原细菌和病毒以及外部刺激和环境毒素的第一道屏障和反应者。近端呼吸器官的气道上皮由俱乐部细胞、纤毛细胞、基底细胞和杯状细胞以及神经内分泌细胞组成。远端气道上皮由俱乐部细胞、纤毛细胞和神经内分泌细胞组成（Rock和Hogan，2011年；Davis和Wypych，2021年）。这些气道上皮细胞具有多种功能，如物理屏障、免疫反应和细胞因子分泌以及黏液纤毛清除。
据我们所知，动物模型中尚未鉴定或验证NPT暴露及其相关损伤的生物标志物。到目前为止，有两种类型的尿液代谢物——即巯基酸代谢物和萘酚结合物——已被用作NPT暴露的指标。巯基酸在60多年前首次被鉴定为萘的尿液代谢物。在先前的研究中，所有接受NPT处理的物种（包括啮齿动物和人类）都通过尿液产生并排泄这些代谢物（Boyland和Sims，1958年）。此外，萘暴露还会产生几种有用的生物标志物，包括1-羟基萘和2-羟基萘，这些标志物可用于评估全身对PAHs的暴露情况，类似于1-羟基芘的使用方式（Rappaport等人，2004年；Sudakin等人，2013年）。然而，尚未明确鉴定出NPT暴露后对其呼吸上皮具体影响的分子生物标志物。
在这里，我们在呼吸器官中鉴定出针对环境毒素（例如萘）的新分子生物标志物。我们使用转录组分析来识别对照组和萘暴露组之间呼吸器官中差异表达的基因，并分离出对萘的早期反应基因（ERGs），以测试它们的时空表达。我们还确认了这些ERGs在呼吸器官、BALF细胞和一个人类气道上皮细胞系中的细胞类型特异性表达，以及它们受到萘的细胞和组织特异性调控。我们的发现表明，这些ERGs可能作为呼吸系统中环境毒素的有用分子生物标志物。
实验部分
小鼠饲养和萘腹腔（i.p.）注射
本研究中的所有动物护理和实验程序均获得了韩国顺天乡大学（SCH）动物伦理委员会的批准（编号SCH22–0031）。萘（Sigma-Aldrich，147141）溶解在玉米油（Sigma-Aldrich，C8267）中。10-15周龄的小鼠被腹腔注射玉米油作为对照组或50、100和200毫克/千克体重的萘。对照组小鼠以及萘处理后6、12和24小时的小鼠被麻醉
萘对假复层气道上皮的损伤
已知萘（NPT）会损害气道上皮细胞，尤其是俱乐部细胞（Van Winkle等人，1995年；Van Winkle等人，1999年）。为了确认NPT对气道上皮的急性损伤，小鼠被腹腔注射200毫克/千克的NPT，并在注射后6、12或24小时收集气管和肺部样本。在注射后6小时，我们没有观察到暴露于NPT的气道上皮与对照组相比有组织学变化（图1A和B）。在注射后12小时，我们
讨论
在这里，我们鉴定出由环境毒素萘（NPT）诱导的早期反应基因（ERGs），并描述了它们在人类气道上皮细胞、支气管肺泡灌洗液（BALF）和小鼠呼吸组织中的表达情况。我们建议将这组ERGs作为分子生物标志物，用于检测暴露于NPT的人类的呼吸损伤。
呼吸器官的气道上皮细胞形成了与外部环境的屏障
作者贡献声明
韩惠贞：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、数据管理。阿玛图夫申·巴萨安库：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、数据管理。博贡·金：验证、软件、正式分析。安吉拉·阿斯特里德·塞卡尔·普拉梅斯瓦里：验证、方法学、数据管理。卡琳娜·卡拉尼：验证、方法学、数据管理。保罗·潘扎：撰写——原始草稿、验证、数据管理。尚武·李：资源、数据管理。吴根·金：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了韩国环境产业技术研究院（KEITI）在“环境疾病预防和管理核心技术发展项目”（RE2021003310003）下的资助，以及韩国教育部和韩国国家研究基金会的“产业-大学合作3.0”项目的支持。C.-H.K.得到了韩国国家研究基金会的资助（RS-2024-00443043）。
