《Scientia Horticulturae》：Construction of a DNA fingerprinting system for tea plant (
Camellia sinensis) germplasm resources based on KASP-SNP markers: a case study of Damiaoshan tea accessions
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本研究针对茶树(Camellia sinensis)种质资源因长期交流引进导致的同名异物、同物异名问题，开发了基于竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术平台的DNA指纹图谱系统。通过对48份茶树种质进行简化基因组测序，从207万个高质量单核苷酸多态性(SNP)中筛选出55个功能相关标记，最终仅需9个核心SNP即可100%区分所有材料，并为每个品种生成条形码和二维码"分子身份证"。该研究为茶树品种鉴定、育种者权利保护和种子质量控制提供了高效、准确且成本低廉的技术方案。
在茶香四溢的茶园中，一个看似简单却困扰茶产业多年的难题正在悄然发酵——如何准确区分形态相似的不同茶树品种？茶树(Camellia sinensis)作为重要的多年生经济作物，在全球60多个国家和地区广泛种植。然而，由于长期的种质交换和引种，茶树品种普遍存在"同名异物"（不同品种使用相同名称）和"同物异名"（同一品种有不同名称）的现象，这不仅给品种鉴定带来困难，更严重阻碍了育种进展和植物新品种权的有效保护。
传统上，茶树品种选育多依赖于从自然授粉群体中选择优良单株或采集优质种子繁殖后代。这种方法虽然为茶产业发展做出了贡献，但茶树育种面临着周期长、自交不亲和性强、基因组高度杂合等挑战。中国国家茶树种质资源库保存有3500多份资源，加上省市级的收集，构成了全球最大、遗传多样性最丰富的茶树基因库。尽管如此，在准确鉴定、高效评价和有效利用方面仍存在诸多问题。
正是在这样的背景下，贵州大学茶学院的研究团队在《Scientia Horticulturae》上发表了创新性研究成果。他们开发了一套基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR, KASP)技术平台的高分辨率DNA指纹图谱系统，为茶树品种鉴定提供了全新的解决方案。
关键技术方法概述
研究团队选取了48份茶树种质资源，包括46份来自广西柳州苗山地区独特种质资源库的优良育种材料以及'福鼎大白茶'和'桂绿1号'两个广泛栽培的对照品种。通过简化基因组测序技术，获得约6028万个SNP位点，经过严格生物信息学过滤后保留207万个高质量SNP用于后续分析。采用KASP技术对筛选出的SNP标记进行基因分型，最终建立了一套完整的DNA指纹图谱系统。
群体SNP鉴定与特征分析
通过对48个样本的简化基因组测序，研究共获得139.20 Gb的高质量清洁数据，Q30值均在94.87%以上。测序reads与参考基因组的平均比对率达到98.78%。共检测到6240.47万个SNP位点，其中4728.22万个为转换型，1512.24万个为颠换型，平均转换/颠换(Ti/Tv)比为3.13。经过严格过滤后，最终获得207.2112万个高质量SNP用于群体遗传分析。
群体结构揭示茶树种质间遗传关系
基于高质量SNP集的群体遗传分析显示，48份种质资源可清晰地分为5个遗传类群。主成分分析(PCA)表明，第一主成分(PC1)解释了12.59%的变异。系统发育树和群体结构分析结果与PCA高度一致，均将材料分为5个明显类群。值得注意的是，来自相同地理起源的种质资源往往表现出更近的遗传关系，如来自广西柳州三江县的品种主要聚集在类群I和II中，而来自融水县的品种则分布在其他类群。
KASP引物设计与SNP核心位点筛选
从207万个高质量SNP中，研究团队通过多步严格筛选流程，最终选出208个具有高多态性(多态信息含量PIC>0.35)、独特基因组位置和最优侧翼序列的SNP标记。成功设计了140个(67.3%)KASP标记，其中39.3%位于外显子区域。通过基因分型验证，发现仅需9个核心SNP标记即可100%区分所有48份材料，显示出极高的鉴别效率。
DNA指纹图谱构建
基于9个核心SNP的基因型数据，研究成功为每个种质资源建立了独特的DNA指纹，并生成了相应的条形码和二维码指纹图谱。这种"分子身份证"系统为今后的身份验证和育种权保护提供了实用工具。
研究结论与意义
这项研究首次成功将KASP技术应用于茶树DNA指纹图谱构建，标志着茶树分子鉴定方法从基于高通量测序的发现阶段向针对育种项目的成本效益高、效率高的解决方案转变。与之前主要使用SLAF-seq等测序方法进行SNP发现的研究相比，该研究不仅代表了技术创新，更体现了应用重点的战略转变。
研究团队采用的"质量优于数量"策略强调，对于遗传背景相近的育种群体，实现高精度鉴定并不依赖于大量标记，而关键在于标记质量和代表性。所有9个最终标记的PIC值均超过0.35，其中43.3%位于0.370至0.375的高多态性范围，确保了每个位点强大的鉴别能力。
这项研究建立的SNP-KASP工作流程为茶树种质鉴定、纯度保证和育种者知识产权保护提供了强大而便捷的工具，从而促进了茶树分子育种的进展。需要注意的是，当前核心SNP组的高鉴别能力已在本研究定义的范围内得到验证。其直接应用于更广泛的全球茶树种质的适用性需要进一步验证，这也是未来工作的重要方向。
该DNA指纹图谱系统的建立，不仅有助于解决茶树品种混淆问题，还将为茶树育种工作的规范化、标准化管理提供技术支撑，对促进茶产业高质量发展具有重要意义。随着该技术的进一步完善和推广应用，有望在茶树新品种保护、种子种苗市场监管和茶叶产品质量追溯等方面发挥重要作用。
