FTO介导的CSF3 m6A去甲基化通过下调RLN2表达抑制结直肠癌中NETosis的作用机制

《Cell Biology and Toxicology》：FTO-mediated m6A demethylation of CSF3 suppresses NETosis via downregulation of RLN2 expression in colorectal cancer

本研究发现FTO（脂肪质量和肥胖相关蛋白）介导的m6A（N6-甲基腺苷）去甲基化通过下调RLN2（松弛素-2）表达，从而抑制结直肠癌（CRC）中NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成）的过程。研究通过功能获得/缺失实验证实CSF3（粒细胞集落刺激因子）通过上调RLN2促进CRC肿瘤发生，而FTO过表达可通过m6A修饰负调控CSF3稳定性。该调控轴为CRC治疗提供了新的靶向策略。

　　

Abstract

结直肠癌（CRC）作为全球高发恶性肿瘤，其发病机制仍需深入探索。本研究聚焦CSF3在CRC进展中的关键作用，特别是其通过调控NETosis影响肿瘤微环境的分子机制。研究发现m⁶A修饰作为重要的转录后调控方式，通过FTO介导的CSF3 mRNA去甲基化参与CRC进程。

Introduction

CRC的高死亡率与肿瘤微环境中免疫细胞的异常调控密切相关。中性粒细胞通过NETosis过程释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），在肿瘤进展中发挥双重作用。既往研究表明CSF3（又称G-CSF）在CRC中高表达，但其通过NETosis促进肿瘤的具体机制尚未明确。同时，m⁶A动态修饰在肿瘤中的调控功能日益受到关注，但其对CSF3的调控作用仍待揭示。

Methods

研究通过AOM/DSS诱导构建CRC小鼠模型，从骨髓分离中性粒细胞（纯度88.07%，存活率94.84%）。利用慢病毒载体在HCT116和RKO细胞中实现CSF3、FTO和RLN2的过表达（oe）或敲低（sh）。通过共培养体系评估CRC细胞对中性粒细胞NETosis的诱导作用，采用免疫荧光检测MPO和H3cit标记的NETs形成，ELISA法测定MPO-DNA复合物水平。通过MeRIP和RIP实验分析m⁶A修饰与蛋白结合作用，生物信息学分析基于TCGA和GEO数据库。

Results

1. 1.
   CSF3促进CRC中NETosis
   TCGA数据分析显示CSF3在CRC组织显著高表达。共培养实验表明，oe-CSF3增强NETs形成（Sytox Green荧光强度增加），而sh-CSF3抑制该现象。直接使用G-CSF（2 ng/mL）刺激中性粒细胞同样证实CSF3对NETosis的促进作用。
2. 2.
   CSF3通过RLN2调控肿瘤发生与NETosis
   分子对接显示CSF3与RLN2存在强相互作用（原子距离<3.5 ?）。RLN2在CRC中高表达，且CSF3过表达可上调细胞上清液中RLN2水平。功能实验表明，RLN2回补能逆转sh-CSF3对细胞增殖、迁移/侵袭的抑制作用，并恢复NETosis水平。相反，sh-RLN2可抵消oe-CSF3的促癌效应。
3. 3.
   FTO介导CSF3的m⁶A去甲基化
   CRC细胞中总体m⁶A水平低于正常细胞，而CSF3转录本的m⁶A富集度升高。FTO在CRC中低表达，其过表达可降低CSF3 mRNA的m⁶A修饰水平和稳定性。RIP实验证实FTO直接结合CSF3转录本，介导其去甲基化。
4. 4.
   FTO/CSF3/RLN2轴调控NETosis与肿瘤发生
   体外实验中，oe-FTO抑制CSF3/RLN2表达及NETosis，而oe-CSF3可逆转该效应。小鼠体内实验进一步验证：oe-FTO组体重恢复、肿瘤数量/尺寸减少，组织中Ki-67表达下降，NETs形成受抑制，且CSF3/RLN2表达同步降低。

Discussion

本研究揭示了一条新型调控轴：FTO通过m⁶A去甲基化降低CSF3 mRNA稳定性，进而抑制RLN2表达，最终减弱NETosis和CRC进展。该发现不仅阐明m⁶A修饰在肿瘤免疫微环境中的调控作用，还为靶向FTO/CSF3/RLN2通路提供了理论依据。

Conclusion

FTO-CSF3-RLN2轴通过调控NETosis影响CRC进展，其中m⁶A修饰是关键分子开关。该通路组分有望成为CRC诊断标志物或治疗靶点。