《OncoImmunology》：Oncolytic virus OVV-03 enhances CAR-T cell therapy against glioblastoma via immune modulation and specific HER2 upregulation
ABSTRACT
胶质母细胞瘤（GBM）由于治疗抵抗和免疫抑制而仍然具有治疗挑战性。溶瘤病毒疗法提供了一种有前景的策略。本研究设计了OVV-03，一种新型的携带HER2基因的溶瘤性水疱性口炎病毒（VSV），并评估了其对抗GBM的功效。OVV-03在GBM细胞系和患者来源的细胞中表现出强大的感染性和细胞毒性，诱导caspase依赖性凋亡并抑制增殖/克隆形成能力。在鼠GBM模型中，OVV-03显著抑制肿瘤生长，改善生存率，并增强CD8+T细胞浸润。单细胞RNA测序显示，OVV-03通过增强细胞毒性T细胞活性和抑制免疫抑制通路（特别是PD-L1/PD-1信号传导）来重塑肿瘤免疫微环境。从机制上讲，OVV-03通过抑制JNK–c-Fos/c-Jun轴下调PD-L1，该作用可被TNF-α刺激所逆转。关键的是，OVV-03与B7H3或HER2靶向的CAR-T细胞协同作用，在原位模型中诱导了优异的肿瘤消退和延长的生存期。这些发现表明，OVV-03通过直接溶瘤和免疫激活（包括PD-L1调节）发挥强大的抗肿瘤作用。其与CAR-T细胞的协同组合突显了OVV-03作为GBM的高度有前景的溶瘤免疫病毒治疗平台。
1 Introduction
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，其特征是高度异质性、广泛浸润和对治疗抵抗。尽管广泛使用传统疗法如手术切除、放疗和化疗，但复发率仍然极高，中位生存期约为15个月，5年生存率低于10%。GBM的高度免疫抑制肿瘤微环境（TME）被认为是治疗失败的主要原因之一。这种微环境损害了免疫细胞的有效浸润和激活，使得通过常规疗法难以消除肿瘤。
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液恶性肿瘤中显示出显著的临床成功，特别是在急性淋巴细胞白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤中，显示出强大的治疗潜力。然而，其在实体瘤中的应用仍然充满挑战，其中之一是肿瘤抗原的异质性和丢失。肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫监视，最常见的是在肿瘤进展过程中逐渐丢失CAR-T细胞靶向的抗原表达，如HER2和EGFRvIII。此外，肿瘤细胞激活免疫检查点通路，如PD-L1/PD-1和CTLA-4，以抑制T细胞功能，进一步逃避免疫系统的攻击。PD-L1的上调，特别是在像GBM这样的实体瘤中，已被证明是免疫逃逸的关键机制。免疫检查点分子抑制T细胞的激活和功能，阻止有效的CAR-T细胞介导的细胞毒性。因此，靶向免疫检查点抑制或其他策略以增强抗原表达对于解决免疫逃逸和提高CAR-T细胞疗法的疗效至关重要。
溶瘤病毒（OVs）是一类选择性感染和裂解肿瘤细胞同时激活宿主免疫系统的病毒。通过裂解肿瘤细胞，OVs释放肿瘤相关抗原，诱导免疫原性细胞死亡（ICD），并引发强烈的局部免疫反应。除了直接的溶瘤作用外，OVs可以通过基因工程改造携带免疫调节因子，如细胞因子、趋化因子或肿瘤抗原，以进一步增强免疫反应。作为一种新兴的治疗方法，OVs在实体瘤免疫治疗中显示出巨大的潜力，特别是在克服肿瘤免疫逃逸和增强免疫细胞疗法的有效性方面。
在本研究中，我们开发了一种新型工程化溶瘤病毒OVV-03，它源自水疱性口炎病毒（VSV）平台并含有HER2基因。通过这种设计，OVV-03能够在GBM肿瘤细胞表面高效表达HER2抗原，从而增强HER2靶向CAR-T细胞的识别和细胞毒性能力。OVV-03不仅发挥强大的溶瘤作用，还通过调节免疫检查点和重编程肿瘤免疫微环境来增强CAR-T细胞在GBM中的疗效。我们的研究结果表明，OVV-03通过重塑免疫微环境和恢复抗原表达，显著增强了CAR-T细胞介导的抗肿瘤反应，从而为GBM治疗建立了一个新型的免疫治疗平台。
2 Materials and methods
2.1 Research period
研究时间为2024年3月至2025年6月。
2.2 Cell lines and cell culture
原代细胞系SHG140和SHG141取自苏州大学附属第一医院患者的GBM组织。U87、U251、LN229、A172和GL261细胞系购自ATCC。GL261-Luc和U87-Luc通过转染荧光素酶报告基因质粒产生。所有细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。
2.3 Construction and Production of oncolytic virus OVV-03
基于水疱性口炎病毒（VSV）Mudd-Summer血清型的基因组序列，对编码M、P、N、G和L蛋白的基因进行密码子优化。化学合成密码子优化后的病毒基因组，并利用定点突变和分子克隆构建了一系列携带不同突变的VSV质粒。转染包装细胞系后，拯救重组VSV毒株，进行噬斑纯化并扩增以产生均一的病毒储备。经过全面的体外和体内溶瘤功效及全身毒性评估后，选择表现出最佳安全性和强大肿瘤裂解活性的减毒VSV毒株作为进一步工程化的骨架。相应的骨架质粒命名为pJB-00，并保存在上海君实生物医药科技有限公司，作为后续抗原表达载体开发的基础。
使用XhoI和NheI内切酶线性化修饰后的pJB-00质粒，并通过PCR扩增HER2核酸片段。该HER2核酸片段具有带双酶切位点的同源序列。然后使用重组方法将片段重组到质粒的酶切位点之间，获得携带HER2抗原基因的VSV溶瘤病毒核心质粒pJB-HER2。利用反向遗传学技术拯救具有所需突变位点和HER2抗原的VSV-HER2溶瘤病毒。对VSV-HER2进行两轮单斑筛选后，扩增VSV-HER2病毒种子库，并测定其滴度。该病毒命名为OVV-03，在-80°C保存直至使用。
2.4 Cell viability assay and colony formation assay
将GBM细胞以每孔6000个细胞的密度接种在96孔板中，培养基总体积为100μL。经过各种处理后，向每孔加入10μL CCK-8试剂，并在37°C孵育1小时。使用酶标仪在450nm波长处测量吸光度以评估细胞活力。对于集落形成实验，将细胞（每孔1000个）接种于6孔板中，每孔加入2mL培养基。细胞培养14天，每3天更换一次培养基。用4%多聚甲醛固定15分钟后，用0.5%结晶紫染色20分钟。
2.5 Flow cytometry analysis
采用流式细胞术评估人GBM细胞系（U251、U87、LN229、A172）和患者来源的原代GBM细胞（SHG140、SHG141）表面HER2和PD-L1的表达，并使用Annexin V/PI染色评估细胞凋亡。病毒感染后，用荧光标记的抗体染色：抗HER2和抗PD-L1用于表面标志物检测，Annexin V-FITC/PI用于凋亡评估。对于体内免疫分析，用抗CD3、抗CD45、抗CD4和抗CD8抗体对小鼠脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞进行染色以鉴定T细胞亚群。使用抗PD-1抗体评估CD3+T细胞与GBM细胞共培养后表面PD-1表达的变化。使用流式细胞仪进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件分析数据。应用设门策略区分特定细胞群，并量化中位荧光强度（MFI）和相对细胞百分比。生成代表性直方图以可视化HER2、PD-L1和凋亡标志物的表达差异。
2.6 Western blot analysis
使用补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取总细胞蛋白。裂解液在4°C下以12,000×g离心15分钟，收集上清液。使用NanoPhotometer N50测定蛋白质浓度。样品在5×SDS上样缓冲液中稀释。等量蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到硝酸纤维素（NC）膜上。膜在室温下用Western Blot（WB）快速封闭缓冲液封闭1小时，随后在4°C下与稀释在封闭缓冲液中的一抗孵育过夜（Caspase3、Cleaved-Caspase3、PARP、Cleaved-PARP、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos、β-Tubulin、GAPDH）。用含有0.1% Tween-20的TBS（TBST）洗涤后，膜在室温下与HRP标记的二抗（抗兔IgG、抗小鼠IgG）孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）试剂进行信号检测，并使用ImageJ软件量化条带强度。将光密度分析标准化为内参，以评估相对蛋白质表达水平。
2.7 Immunofluorescence staining
将细胞在有或无OVV-03的情况下在12孔板中培养48小时。孵育后，用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，用PBS洗涤，并封闭20分钟。封闭后，细胞在4°C下与适当的一抗（Ki67、Cleaved-Caspase3）孵育过夜。用PBS洗涤后，细胞在室温下与荧光标记的二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG）孵育1小时。使用DAPI进行核染色。所有必要步骤均在暗处进行。
2.8 Animal studies
所有动物程序均获得苏州大学实验动物中心的批准。使用雌性BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠（4-6周龄）建立颅内肿瘤模型。对于皮下胶质瘤模型，使用C57BL/6小鼠（6-8周龄，雌性）。小鼠在标准条件下饲养，12小时光/暗循环，自由获取食物和水。
对于小鼠颅内模型，使用雌性BALB/c裸鼠（4-6周龄）和C57BL/6小鼠（4-6周龄）进行颅内肿瘤植入。用3-5%异氟烷在诱导室中麻醉小鼠，并维持在1.5-2%异氟烷下。将肿瘤细胞（GL261-Luc、U87-Luc）重悬于4μL PBS中，并立体定向注射到大脑左半球（中线旁2mm，前囟后2mm，深度3mm）。注射后针头在原位保持5分钟，然后缓慢撤回。用骨蜡密封颅骨孔。将动物随机分配到实验组或对照组，并使用相同的注射程序用OVV-03或CAR-T进行处理。细胞植入后，每周进行活体生物发光成像（IVIS）以监测荧光素酶活性和肿瘤生长。根据伦理指南，对表现出痛苦、共济失调或体重减轻>20%的小鼠实施安乐死。通过使用递增浓度的二氧化碳（CO2）吸入（每分钟20-30%体积置换）进行安乐死，随后进行颈脱位以确保死亡。
为了建立皮下胶质瘤模型，将5×105个小鼠GL261胶质瘤细胞悬浮于100μL PBS中，注射到C57BL/6小鼠（6-8周龄，雌性）的右侧腹（单侧模型）或双侧腹（双侧模型）。让肿瘤生长直至达到可触及的大小（大约植入后第7天），此时给小鼠瘤内注射OVV-03（7×109PFU，溶于10μL）或载体对照。在双侧模型中，仅对右侧肿瘤进行治疗。每三天注射一次，总共三次剂量。使用数字卡尺测量肿瘤体积，并使用公式计算：体积=（长×宽2）/2。定期监测小鼠的肿瘤生长，并在植入后第10、13、16和20天记录肿瘤大小。所有小鼠在第20天安乐死以摘除肿瘤。如上所述通过CO2吸入进行安乐死。绘制相对肿瘤体积图，并进行统计分析以比较治疗效果。本研究遵循ARRIVE指南，并获得苏州大学附属第四医院批准（批准号220082）。
2.9 Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)
新鲜组织在手术后30分钟内保存在冰上的sCelLive?组织保存液中。标本用HBSS洗涤，切碎，并在sCelLive?组织解离液中使用Singleron系统消化（37°C，15分钟）。细胞悬液通过40μm滤网过滤，用GEXSCOPE?红细胞裂解缓冲液处理（体积比1:2，室温，5-8分钟），离心（300×g，4°C，5分钟），重悬于PBS中，并用台盼蓝评估活力。将单细胞悬液（2×105个细胞/mL）加样到微孔芯片上。条形码磁珠捕获mRNA用于逆转录、cDNA扩增、片段化和接头连接。使用GEXSCOPE?单细胞RNA文库试剂盒制备scRNA-seq文库，以4nM浓度混合，并在Illumina NovaSeq 6000上（150-bp双末端）进行测序。通过CeleScope v2.0.7处理原始读数：Cutadapt v1.17修剪接头/聚A尾，featureCounts v2.0.1生成UMI/基因表达矩阵。
2.10 scRNA-seq data processing and analysis
使用Python 3.10中的Scanpy v1.9.3进行质量控制、降维和聚类。通过排除基因数<200或基因计数、umi计数前2%、线粒体含量>20%、以及在<5个细胞中检测到的基因的细胞进行过滤。质控后的数据集平均每个细胞有1692个基因和4429个umis。缩放后的变量进行PCA分析，使用前15个主成分进行聚类和UMAP可视化。差异基因表达分析采用scanpy的rank_genes_groups函数（Wilcoxon秩和检验），识别满足以下阈值的DEGs：在任一群体中超过10%的细胞中表达，|平均log倍变化|>0.25，且Benjamini-Hochberg调整后p值<0.05。所有可视化（特征图、条形图、热图）均使用Seurat集成函数和ggplot2生成。使用R中的clusterProfiler v3.16.1对GO和KEGG术语进行下游通路富集分析。
2.11 Statistical analysis
使用统计软件Prism 10.0。Student’s t检验用于比较两个独立组，采用Tukey校正的单因素ANOVA模型用于比较三个或更多组。动物生存时间通过Kaplan-Meier法呈现，p值通过对数秩检验计算和比较。数据显示为平均值±标准差。所有检验均为双侧。与p < 0.05相关的差异被认为具有统计学意义。
3 Results
3.1 Construction of OVV-03 and assessment of its infectivity and cytotoxicity in glioblastoma cells
我们通过插入HER2转基因构建了重组溶瘤VSV OVV-03，使用OVV-00（表达GFP）作为同基因对照。在多个胶质母细胞瘤模型（包括细胞系U87、U251、LN229、A172和患者来源的原代细胞SHG140、SHG141）中的流式细胞术分析表明，仅在OVV-03感染的细胞中，在不同感染复数（MOI为0.1、1、10）下，HER2表面表达显著上调。在所有模型中，HER2表达在感染后24小时（hpi） consistently达到峰值，证实了有效的病毒感染和快速的转基因递送，确立了HER2作为追踪感染的可靠生物标志物。
通过CCK-8法在U87、患者来源的SHG141和小鼠GL261细胞中评估细胞毒性，结果显示OVV-03具有显著且剂量和时间依赖性的细胞杀伤作用。U87细胞从12 hpi（较高MOI）到48 hpi（所有MOI）表现出细胞毒性。SHG141原代细胞在24 hpi和48 hpi显示出类似的强效剂量依赖性细胞毒性，但与U87细胞相比，其起效延迟，在12 hpi时无显著效应。GL261细胞表现出可比的细胞毒性动力学，证实了广泛的功效。
3.2 OVV-03 induces apoptosis and suppresses clonogenic capacity in GBM cells in vitro
为了表征细胞毒性机制，我们首先使用Annexin V/碘化丙啶（PI）染色量化凋亡诱导。OVV-03感染在建立的U87细胞系和关键的患者来源的SHG141原代GBM细胞中，均引发了早期凋亡（Annexin V+PI-）和晚期凋亡/坏死（Annexin V+PI+）细胞群的显著增加。这种跨模型系统的稳健凋亡诱导突显了OVV-03克服GBM中常见的内在凋亡抵抗的能力。为了获得空间和功能上的见解，我们进行了关键标志物的免疫荧光（IF）染色。OVV-03处理显著抑制了细胞增殖，表现为U87和SHG141细胞中Ki67阳性核的显著减少。同时，OVV-03有效激活了凋亡级联反应，表现为cleaved caspase-3（C-casp3）阳性细胞的显著增加。这种双重作用——抑制增殖同时主动执行细胞死亡——突出了病毒直接介导的对GBM细胞存活的多方面攻击。使用集落形成实验，我们评估了OVV-03对长期克隆形成存活的影响。OVV-03感染深刻且显著地损害了U87和SHG141细胞的集落形成能力。在有效MOI下集落形成近乎完全消失，强烈表明OVV-03有效靶向并消除了负责肿瘤再生和复发的GBM细胞亚群，这是临床神经肿瘤学中的一个重大挑战。为了阐明OVV-03诱导凋亡的分子通路，我们进行了免疫印迹分析。OVV-03处理导致关键凋亡介导物的显著上调：cleaved caspase-3（C-casp3）和cleaved poly ADP ribose polymerase（C-PARP）的水平增加。为了证实对该通路的功能性依赖，我们采用了caspase抑制试验。同时，用泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理显著减弱了OVV-03诱导的C-casp3升高。经典caspase依赖性凋亡通路的明确激活为观察到的强效细胞毒性和促凋亡效应提供了机制基础。cleaved PARP的诱导尤其重要，证实了细胞不可逆地走向死亡。
3.3 OVV-03 exerts potent antitumor effects and remodels the glioma immune microenvironment in vivo
OVV-03控制颅内肿瘤生长并延长生存期。纵向生物发光成像显示，对照组小鼠中肿瘤来源的信号稳定且进行性增加，最终导致统一死亡。与之形成鲜明对比的是，颅内给予OVV-03诱导了快速且持续的肿瘤生长抑制，这通过第一次治疗后不久生物发光信号强度的显著降低得以证明。定量分析证实，与对照组相比，OVV-03组的相对平均辐射强度显著较低。关键的是，在接受 concomitant CD8+T细胞清除抗体（OVV-03 + 抗CD8组）的小鼠中，这种治疗效果被完全消除，其肿瘤进展动力学与对照组相似。这一结果明确证明OVV-03的抗肿瘤功效依赖于CD8+T细胞。因此，在OVV-03组观察到的强效肿瘤控制转化为荷瘤小鼠中位生存期的显著延长。为了剖析OVV-03在脑TME内的免疫学影响，我们对解离的肿瘤组织进行了流式细胞术分析。OVV-03处理显著增加了TME内CD45+白细胞的总浸润和CD45+CD3+T淋巴细胞的频率。关键的是，我们观察到CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的显著富集。这种向CTL主导的浸润的转变表明，OVV-03有效对抗深度免疫抑制的GBM TME并促进效应T细胞反应。OVV-03引发系统性抗肿瘤免疫和远隔效应。为了评估适应性系统性免疫的诱导，我们在免疫健全小鼠中建立了双侧皮下GL261胶质瘤模型。将OVV-03瘤内注射到右侧腹肿瘤中导致显著的生长抑制，肿瘤体积随时间推移逐渐减小（治疗效应）。关键的是，在未注射的对侧左腹肿瘤中也观察到了强劲的肿瘤生长抑制（远隔效应）。随后的免疫荧光染色显示，在OVV-03处理组中，未经治疗的左侧肿瘤的肿瘤微环境内CD8+T细胞浸润有强劲且显著的增加，并且我们在未治疗的左侧肿瘤中发现了坏死病灶。这种远隔效应提供了令人信服的证据，表明OVV-03处理启动了系统性肿瘤特异性T细胞反应，能够介导针对远处、抗原匹配的肿瘤部位的抗肿瘤免疫，细胞毒性CD8+T细胞向远处未治疗肿瘤部位的募集是驱动观察到的远隔效应的可能机制，最终导致肿瘤细胞死亡和坏死。H&E染色揭示了深刻的形态学改变。来自OVV-03处理组的肿瘤表现出广泛的地图状坏死、细胞结构的完全破坏和组织完整性的丧失，而对照肿瘤保留了紧凑和有组织的细胞结构。这种损伤模式与观察到的免疫细胞浸润和系统性免疫激活一致。
3.4 OVV-03-mediated remodeling of the glioma immune microenvironment revealed by single-cell RNA sequencing
为了获得OVV-03如何重塑复杂胶质母细胞瘤免疫景观的无偏倚、高分辨率视图，
