《Insects》：Study on the Stability of Reference Genes and HSP60 for Expression Analysis in Chilo suppressalis in Response to Humidity Stress
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本研究通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，系统评估了九种候选内参基因在二化螟不同发育阶段（幼虫、蛹、成虫）响应干旱或复水胁迫时的表达稳定性。研究采用?Ct法、geNorm、NormFinder和BestKeeper四种分析方法，发现18S rRNA、ACTIN、TUB等基因的稳定性存在显著发育阶段特异性，并验证了双内参基因组合的归一化可靠性。该研究为昆虫湿度应激分子机制研究提供了关键的技术支撑。
1. 引言
水分平衡调节是所有生物体内稳态的主要组成部分。在昆虫中，水在代谢物运输、大分子结构维持以及时空分布变异确定等方面起着至关重要的作用。然而，由于体型相对较小和表面积与体积比高，昆虫在维持水分平衡方面面临重大挑战。因此，昆虫进化出许多管理水分的策略，例如具有丰富疏水性表皮脂质的体壁、驯化处理以及调节水渗透性的蛋白质。随着全球气候变化，包括极端温度、降雨模式改变和干旱在内的环境条件将频繁发生。了解昆虫对水分可用性的反应非常重要，因为它对其生存、分布模式和物种丰富度具有显著影响。尽管如此，昆虫体内水分复水和干燥抵抗的分子机制仍然知之甚少。
二化螟是一种重要的水稻和茭白害虫，广泛分布于温带和亚热带亚洲、南欧和北非。在中国，二化螟的一龄至六龄幼虫钻入水稻和茭白的茎秆，是该害虫对作物造成危害的主要阶段。二化螟造成的危害已蔓延至中国十多个省份，并逐渐加剧。幼虫喜欢干燥环境化蛹，而蛹偏爱高湿条件，但不耐涝。几天后，蛹羽化为成虫，在寄主植物上产卵。二化螟的所有发育阶段都喜欢高湿环境。在二化螟的防治中，常利用湿度来调节其危害。为了改善二化螟的绿色防控，阐明其在不同发育阶段响应干燥或复水胁迫的分子机制至关重要。
更精确的二化螟基因组和更多转录组数据现已可用。基因表达分析对于识别不同生物体中各种基因的功能非常重要。实时荧光定量PCR是一种高可靠性、高灵敏度和高操作性的技术，可用于测量和评估功能基因表达。尽管qRT-PCR通常被描述为基因表达分析的黄金标准，但结果的可靠性直接受到某些因素的影响，例如RNA质量和数量、反转录效率和引物设计。因此，使用适当的内参基因进行准确的基因表达归一化对于获得可靠的基因表达水平至关重要。内参基因，通常称为看家基因，基于其假定的组成型表达，例如ACTIN、18S核糖体RNA和微管蛋白。然而，值得注意的是，这些基因受到不同处理条件的影响，并且不存在通用的内参基因。此外，用于归一化的内参基因数量也会影响qRT-PCR的结果。因此，为了确保结果准确，针对具体实验验证内参基因至关重要。
本研究评估了九种候选内参基因在二化螟不同发育阶段处于干燥或复水条件下的表达稳定性，包括18S rRNA、ACTIN、TUB、延伸因子1、泛素结合酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、组蛋白3、精氨酸激酶和核糖体蛋白S11。为了进一步评估结果，分析了热休克蛋白60基因的表达谱。本研究结果可为未来研究这一重要害虫物种的水分适应相关基因提供支持。
2. 材料与方法
2.1. 昆虫
二化螟采集自扬州稻田，并在人工食料上于环境培养箱中饲养，温度28±1°C，光周期16:8（光照/黑暗），相对湿度70±5%。
2.2. 不同湿度处理下的样品收集
根据初步实验，将五龄幼虫、雄蛹和雌蛹、雄成虫和雌成虫暴露于湿度箱中25%（干燥）、50%、75%和95%（复水）的相对湿度下24小时，湿度箱相对湿度精度为±1.5%，温度27°C。三龄幼虫分别暴露于25%（干燥）、50%、75%和95%（复水）的相对湿度下12小时。每个处理包括30头二化螟，存活的二化螟立即在液氮中冷冻并储存于-80°C。
2.3. 内参基因的选择
选择ACTIN、TUB、EF1、H3、RPS11、NADHD、AK、18S rRNA和UBI作为内参基因，并验证了其引物的特异性和扩增效率。
2.4. RNA提取与反转录
使用SV总RNA分离系统从每个样品中分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，然后通过分光光度法测量RNA纯度和浓度。然后，使用0.50 μg总RNA，使用Bio-Rad iScriptTM cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。
2.5. 实时荧光定量PCR分析
将稀释10倍的cDNA用作qRT-PCR分析的模板。PCR反应混合物包含10 μL iTaq Universal SYBR Green supermix (2×)、1 μL每种基因特异性引物 (10 μM)、2 μL cDNA模板和6 μL ddH2O。所有反应均在CFX-96实时PCR系统上进行。具体程序包括95°C初始变性3分钟，随后在95°C变性30秒，并在引物对的Tm值下退火/延伸30秒，共40个循环。进行从65°C到95°C的熔解曲线分析以确定扩增PCR产物的特异性。每个处理包括四个生物学重复，每个重复进行三个技术重复。
2.6. 统计分析
阈值循环值定义为荧光信号达到预设阈值所需的扩增循环数，该阈值在所有反应中设置为一致的荧光强度。使用?Ct方法、BestKeeper、NormFinder版本0.953和GeNorm版本3.5评估9种候选内参基因的稳定性。?Ct方法结果的标准差越低，表明基因越稳定。BestKeeper创建一个指数，指数得分越低表明稳定性越高。NormFinder估计表达变异，其中值越低越稳定。geNorm算法计算表达稳定性值M，并比较基因与其他基因的配对变异V。geNorm算法使用0.15作为截止值，Vn/Vn + 1比值超过0.15表明需要额外的内参基因。
2.7. 内参基因的验证
选择二化螟中的Hsp60作为靶基因来验证稳定的内参基因。根据不同处理条件下Hsp60的相对表达水平，按照2???Ct方法进行。将75%相对湿度下的Hsp60表达用作校准对照。对于使用多个内参基因进行归一化，分别对每个内参基因进行归一化，然后对结果取平均值。使用SPSS v. 16.0进行单因素方差分析以进行比较。
3. 结果
3.1. 总RNA质量与PCR扩增特异性
通过qRT-PCR研究了二化螟不同发育阶段在干燥或复水条件下ACTIN、TUB、EF1、H3、RPS11、NADHD、AK、18S rRNA、UBI和Hsp60的表达水平。评估了从不同样品中分离的总RNA的完整性、纯度和浓度。总RNA条带在琼脂糖凝胶电泳上完整，表明RNA完整性良好。A260/280比值证实所有RNA样品纯度较高。此外，所有十个基因产生的扩增子在熔解曲线分析中均呈现单峰，表明每个反应扩增出独特的产物。
3.2. 内参基因的表达谱
表达水平表示为扩增达到固定阈值所需的循环数。绘制了不同实验条件下九个候选内参基因的Ct值。九个内参基因的平均Ct值范围从8.45 (18S rRNA) 到29.89 (TUB)。18S rRNA (平均Ct 10.30) 显示出最丰富的表达水平，其次是RPS11 (平均Ct 19.47)、EF1 (平均Ct 21.55)、AK (平均Ct 22.12)、H3 (平均Ct 22.71)、NADHD (平均Ct 24.01)、UBI (平均Ct 24.60)、TUB (平均Ct 26.00) 和ACTIN (平均Ct 27.36)。然而，在三龄幼虫样品中，RPS11显示出最小的Ct变异 (0.13)，TUB显示出最大的Ct变异 (0.56)；对于五龄幼虫，UBI观察到最小的Ct变异 (0.31)，AK观察到最大的Ct变异 (1.32)。在雄蛹样品中，RPS11显示出最小的Ct变异 (0.10)，EF1显示出最大的Ct变异 (0.52)，但在雌蛹中，18S rRNA观察到最小的Ct变异 (0.03)，NADHD观察到最大的Ct变异 (0.57)。在雄成虫样品中，RPS11显示出最小的Ct变异 (0.15)，EF1显示出最大的Ct变异 (1.22)，但在雌成虫中，RPS11观察到最小的Ct变异 (0.24)，18S rRNA观察到最大的Ct变异 (1.22)。这些结果表明，没有单一的内参基因适用于二化螟所有发育阶段在干燥或复水条件下的基因表达归一化。
3.3. 基因表达稳定性分析
对于处于干燥或复水条件下的三龄幼虫，四种综合分析方法的分析发现18S rRNA和NADHD显示出最高的表达稳定性。根据NormFinder，稳定性排名从最稳定到最不稳定为：18S rRNA > EF1 > H3 > UBI > NADHD > RPS11 > ACTIN > TUB > AK。比较?Ct法、NormFinder、BestKeeper和geNorm均显示TUB和AK是相对不稳定的内参基因。对于处于干燥或复水条件下的五龄幼虫，发现ACTIN和TUB显示出最高的表达稳定性。根据NormFinder，稳定性排名从最稳定到最不稳定为：ACTIN > TUB > H3 > 18S rRNA > NADHD > RPS11 > AK > EF1 > UBI。NormFinder和geNorm均显示UBI是最不稳定的内参基因。
对于处于干燥或复水条件下的雄蛹，四种综合分析方法的分析显示TUB和ACTIN最稳定。根据NormFinder，稳定性排名从最稳定到最不稳定为：TUB > ACTIN > UBI > AK > H3 > RPS11 > 18S rRNA > EF1 > NADHD。NormFinder和geNorm均显示NADHD是最不稳定的内参基因。对于处于干燥或复水条件下的雌蛹，发现TUB、ACTIN和UBI显示出最高的表达稳定性。根据geNorm，稳定性排名从最稳定到最不稳定为：UBI/ACTIN > TUB > AK > 18S rRNA > EF1 > H3 > RPS11 > NADHD。比较?Ct法、NormFinder、BestKeeper和geNorm均显示NADHD是最不稳定的内参基因。
对于处于干燥或复水条件下的雄成虫，四种综合分析方法的分析发现UBI和H3显示出最高的表达稳定性。根据geNorm，稳定性排名从最稳定到最不稳定为：RPS11/H3 > NADHD > ACTIN > UBI > TUB > 18S rRNA > AK > EF1。比较?Ct法、NormFinder、BestKeeper和geNorm均显示EF1是最不稳定的内参基因。对于处于干燥或复水条件下的雌成虫，发现EF1、RPS11和UBI显示出最高的表达稳定性。NormFinder分析显示稳定性排名（从最稳定到最不稳定）为：EF1 > NADHD > RPS11 > H3 > ACTIN > UBI > AK > TUB > 18S rRNA。比较?Ct法、NormFinder、BestKeeper和geNorm均显示18S rRNA是最不稳定的内参基因。
3.4. 最佳内参基因数量
geNorm分析还确定了数据归一化所需的最佳内参基因数量。结果显示，在二化螟所有发育阶段处于干燥或复水条件下，V2/3的配对变异值均低于0.15的截止值。这些结果表明，两个候选内参基因足以进行可靠的数据归一化。
3.5. 使用Hsp60验证内参基因
热休克蛋白60是一种普遍存在、高度丰富的分子伴侣，在生态适应中起着重要作用。比较了在干燥或复水条件下使用不同选定内参基因时Hsp60的相对表达。对于三龄幼虫的分析，我们比较了使用以下选定内参基因的Hsp60表达：18S rRNA（最稳定内参基因）、AK（最不稳定）以及两个推荐的内参基因（18S rRNA和NADHD）。使用18S rRNA、AK和组合内参基因获得的Hsp60表达谱趋势相似。然而，当使用ACTIN（最稳定内参基因）、UBI（最不稳定）和组合内参基因对五龄幼虫的Hsp60表达进行归一化时，检测到显著差异。
对于雄蛹和雌蛹的分析，我们比较了使用以下选定内参基因的Hsp60表达：TUB（最稳定内参基因）、NADHD（最不稳定）以及两个推荐的内参基因（TUB和ACTIN）。在雄蛹中，使用TUB或组合内参基因与使用NADHD归一化的Hsp60表达谱存在显著差异。在雌蛹中，当使用TUB（最稳定内参基因）或两个推荐的内参基因（TUB和ACTIN）进行归一化时，Hsp60表达未被诱导。然而，当使用NADHD（最不稳定）进行归一化时，Hsp60的表达谱发生显著变化。
对于雄成虫的分析，我们比较了使用以下选定内参基因的Hsp60表达：UBI（最稳定内参基因）、EF1（最不稳定）以及两个推荐的内参基因（UBI和H3）。组合内参基因与EF1（最不稳定）的Hsp60表达谱存在显著差异。在雌成虫中，使用18S rRNA（最不稳定）时Hsp60表达未被抑制。然而，当使用两个推荐的内参基因（EF1和RPS11）进行归一化时，Hsp60的表达谱被显著抑制。
4. 讨论
qRT-PCR因其特异性、准确性和可重复性已成为检测基因表达水平的重要技术。然而，qRT-PCR的准确性需要利用内参基因进行稳健的归一化。大量研究表明，不存在一种在所有实验条件下通用的内参基因。在本研究中，调查了九种内参基因（ACTIN、EF1、H3、18S rRNA、AK、NADHD、TUB、RPS11和UBI）在二化螟不同发育阶段处于干燥或复水条件下的表达水平。这些内参基因属于不同功能类别的蛋白质，以降低共调控的风险。我们的结果表明，?Ct法、NormFinder、BestKeeper和GeNorm在干燥或复水条件下对九种内参基因显示出不同的稳定性排名。尽管存在差异，但这四种方法的分析在不同实验条件下对最稳定和最不稳定内参基因的排名相似；例如，在暴露于干燥或复水的雌蛹、雄成虫和雌成虫中，NADHD、EF1和18S rRNA分别被列为最不稳定的基因。然而，通过四种分析方法确定的大多数内参基因是不同的。类似地，先前研究中不同程序之间的稳定性排名存在差异，这可能归因于不同的逻辑算法。因此，在本研究中，进一步使用了内参基因稳定性排名的综合分析。
18S rRNA和ACTIN参与基本细胞过程，是最常用于归一化表达的内参基因。然而，一些研究表明18S rRNA和ACTIN并不总是可靠地用于归一化基因表达。在本研究中，发现存在于暴露于干燥或复水的三龄幼虫以及雄性或雌性蛹中的18S rRNA和ACTIN是合适的内参基因。其他研究也报道了一致的结果。TUB在维持细胞形状、调节细胞分裂和促进物质运输方面起着重要作用。RPS11在核糖体组装和蛋白质翻译中起重要作用。EF1通过催化氨酰-tRNA的GTP依赖性结合在蛋白质翻译延伸中发挥作用。UBI对于蛋白质降解和细胞周期调节至关重要。这些基因已在各种昆虫物种中越来越多地被用作内参基因。我们的结果还表明TUB、RPS11、EF1和UBI在不同实验条件下表现出高水平的稳定性。上述内参基因的组合是用于归一化二化螟在干燥或复水条件下表达的最佳基因组合。为了进一步验证内参基因，分析了暴露于干燥或复水的二化螟不同发育阶段Hsp60的表达模式。总的来说，结果表明，使用最稳定的内参基因或其组合归一化的Hsp60表达水平与使用最不稳定的内参基因归一化的表达水平存在显著差异。
5. 结论
昆虫进化出各种适应性生态策略和分子机制来应对湿度胁迫。然而，昆虫适应干燥或复水的分子机制仍然知之甚少。我们的研究系统地调查并验证了九种潜在的内参基因，用于归一化二化螟在干燥或复水条件下的qRT-PCR数据。我们的研究结果表明，二化螟内参基因的表达稳定性随湿度胁迫下的发育阶段和性别而变化。据我们所知，这是首个在昆虫中验证干燥或复水条件下内参基因的研究。这些发现将有助于未来研究二化螟湿度胁迫适应的分子机制。
