《Stress》：Harsh parenting and rs11621961 at the SERPINA6/1 locus: gene-environment interaction effects on hair cortisol in a Brazilian population-based longitudinal study
摘要
头发皮质醇浓度（HCC）是反映长期下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴活性的生物标志物，也是慢性压力的指标。尽管HCC与心理健康相关，但关于遗传易感性和早期逆境如何共同影响皮质醇调节，尤其是在中低收入国家（LMICs）中的研究尚不充分。本研究旨在探讨严厉教养是否可预测青少年HCC，以及这种关联是否受遗传变异的调节。数据来源于2004年巴西佩洛塔斯出生队列的1,823名参与者，随访时间点为6岁、11岁和15岁。遗传数据通过Illumina Global Screening Array v2芯片获得，HCC在15岁时通过ELISA法测量。严厉教养使用亲子冲突战术量表（CTSPC）评估，累积暴露通过线性回归模型进行分析。基因-环境交互作用分析检验了rs11621961是否调节严厉教养与HCC之间的关联。结果显示，累积暴露于严厉教养，尤其是总体严厉教养和体罚，与15岁时较高的HCC相关。G×E交互作用的证据表明，这种关联在携带更多T等位基因拷贝的个体中更强，提示存在基因剂量效应。这些发现强调了在LMIC settings中，遗传易感性如何放大早期生活压力对生理结果的影响。
1. 引言
皮质醇在代谢、免疫功能、心血管稳态和生理应激反应调节中起着核心作用。其合成和分泌由HPA轴控制，并遵循昼夜节律，清晨水平最高。HPA轴失调通常由慢性压力引发，会破坏皮质醇稳态，并与心血管疾病、2型糖尿病、肥胖以及精神障碍相关。
童年早期是压力敏感的关键时期，慢性暴露会增加成年后代谢和精神疾病的风险。严厉教养，包括强制、攻击或心理虐待，是一个主要的公共卫生问题，全球流行率在13%至36%之间，在中低收入国家往往更高。它可能成为儿童的慢性压力源，与负面行为、情绪和认知结果相关。
皮质醇可能是早期虐待（如严厉教养）生理效应的关键生物标志物，严厉教养可能影响调节HPA轴的大脑区域。然而，研究结果不一，可能源于对波动较大的唾液皮质醇的依赖。相比之下，HCC提供了更稳定的慢性压力测量。尽管将逆境与HCC联系起来的研究结果不一致，但近期研究报道了身体强制与儿童HCC升高之间存在正相关。
遗传学可能有助于解释这种变异性，血浆皮质醇的遗传率估计在30-60%之间，HCC的遗传率在65-72%之间。一项全基因组荟萃分析（GWAMA）发现染色体14上的一个位点（SERPINA6/1）参与皮质醇调节，并与早晨血浆皮质醇相关，解释了其1%的方差。此外，一项利用2004年佩洛塔斯出生队列数据的研究发现，rs11621961的T等位基因与青春期较高的HCC相关。这些发现表明，基因-环境交互作用（GxE）可能影响皮质醇调节，那些遗传上易出现调节失调的个体可能对诸如严厉教养之类的压力源更为脆弱。
本研究旨在：1）评估2004年佩洛塔斯出生队列中6岁、11岁和15岁时的严厉教养与15岁时HCC之间的关联；2）检验严厉教养与SERPINA6/1 rs11621961变异位点对HCC的GxE交互作用。假设早期暴露于严厉教养与青春期HCC升高相关。进一步假设T等位基因会调节这种关联，使得携带者表现出严厉教养与HCC升高之间更强的联系，这与HPA轴失调的遗传易感性增加一致。
2. 材料与方法
2.1. 研究设计与参与者
2004年佩洛塔斯出生队列是一项在巴西南部佩洛塔斯市进行的基于人群的研究。在2004年1月1日至12月31日期间，所有在该市出生的儿童均被识别，其中4,231名母亲签署了知情同意书，并与她们的孩子一起被纳入研究。所有参与者在3个月、12个月、24个月、48个月、6岁、11岁、15岁和18岁时进行了重新评估。15岁随访的现场工作因COVID-19大流行于2020年3月提前停止。
本研究分析了6岁、11岁和15岁随访时的严厉教养数据，以及在6岁时收集的遗传数据和15岁随访时收集的HCC数据。严厉教养数据可用于3,560人，遗传数据用于3,472人，15岁时HCC数据用于1,826名参与者。初步分析包括1,823名同时拥有严厉教养和HCC数据的参与者。对于GxE交互作用检验，仅分析了拥有完整遗传、严厉教养和HCC数据的参与者。分析样本选择过程见图1A。
所有实验程序均符合数据收集时强制性的实验室健康与安全规定。
2.2. 严厉教养
在6岁、11岁和15岁随访时，使用了改编版的亲子冲突战术量表（CTSPC）。在每个波次，CTSPC由青少年的主要照顾者（最常见的是生物学母亲）完成。
CTSPC评估与身体和心理儿童虐待相关的养育行为。本研究使用的14个条目的CTSPC版本包括两个分量表：（i）心理攻击（5个条目）和（ii）身体攻击（9个条目），后者包括体罚（5个条目）和身体虐待（4个条目）。所有条目按3点计分（0-2），总分范围0-28分，分数越高表示严厉教养事件发生越频繁。
本研究采用两种互补的分析方法来检查严厉教养暴露：首先，分析6岁、11岁和15岁的平均严厉教养分数，以评估整个儿童期和青春期的总体暴露负荷；其次，使用基于组的轨迹建模（GBTM）来评估严厉教养随时间的轨迹，以捕捉暴露的模式和慢性特征。GBTM能够处理缺失数据。
2.3. 头发样本收集与皮质醇定量
参与者的头发样本在15岁随访时由训练有素的专业人员收集。样本取自头皮后顶叶区域。头发样本在联邦大学佩洛塔斯分校流行病学研究生项目的实验室进行处理，采用标准化方法进行洗涤、研磨、激素提取和皮质醇测量。HCC通过高灵敏度唾液皮质醇免疫测定试剂盒（Salimetrics）采用ELISA技术测量。原始数据中超出平均值四个标准差的异常值被排除。鉴于HCC呈右偏态分布，在回归分析前对其进行对数转换。
2.4. 基因组数据与SNP选择
DNA样本在6岁时使用Oragene Genotek—250 DNA采集试剂盒收集。基因组DNA使用Infinium Global Screening Array 2（Illumina）进行基因分型。对SNP和样本进行质量控制。使用1000 Genomes Project（第3阶段）参考面板对未基因分型的变异进行插补。
SNP rs11621961（SERPINA6/1基因座）的选择基于强有力的先验证据，表明该变异与皮质醇调节相关。CORtisol NETwork（CORNET）联盟关于早晨血浆皮质醇的GWAMA研究，以及2004年佩洛塔斯出生队列的证据均表明rs11621961的变异与皮质醇水平相关。
2.5. 协变量
所有模型均针对可能影响养育行为和皮质醇生物学的社会人口学、围产期、母亲和头发特异性特征进行了调整。包括儿童性别、出生体重、母亲年龄、母亲肤色、家庭收入、母亲教育年限、母亲是否与伴侣同住、母亲产次、母亲孕期吸烟、母亲抑郁症状（12个月时通过爱丁堡产后抑郁量表EPDS测量）、头发类型、自然发色、洗发频率以及过去三个月皮质类固醇使用情况。对于遗传分析，还包括前10个基因组主成分以调整种群结构。
2.6. 统计分析
所有分析均使用Stata 17进行。首先进行样本描述，比较纳入分析与未纳入分析的青少年在协变量上的差异。使用线性和调整线性回归模型检验童年至青春期的严厉教养与15岁HCC的关联。调整模型考虑了上述协变量。使用testparm命令计算分类暴露的整体p值。结果以β系数和95%置信区间（CI）呈现。系数被指数化以得出几何均值，以百分比表示。
GxE交互作用分析通过线性回归进行，包括严厉教养变量、rs11621961的主效应项以及一个乘法交互项，并调整协变量。rs11621961采用加性遗传模型进行检验。使用margins和marginsplot命令绘制图表以显示交互作用。统计学显著性α水平设定为0.05。
2.7. 伦理批准与参与同意
本研究获得了联邦大学佩洛塔斯分校医学院伦理委员会和圣保罗大学伦理委员会的批准。巴西国家研究伦理委员会也批准了基因组数据的使用。获得了母亲或法定监护人的书面知情同意，青少年也签署了知情 assent 表格。
3. 结果
3.1. 样本特征
共1,823名参与者（占15岁时评估人数的89.1%）被纳入分析。队列性别分布均匀（50.8%为女性），平均出生体重为3,182克（SD ± 518.0克）。母亲分娩时平均年龄为26.6岁（SD ± 6.6岁），大多数母亲自称为白人（74.8%）。近半数参与者（45.5%）的母亲受教育年限≥9年，大多数来自母亲与伴侣同住的家庭（85.1%）。此外，38.0%的母亲为初产，25.7%在孕期吸烟，27.4%在产后12个月随访时报告有抑郁症状。
该队列中的严厉教养反映了轻度至中度的行为。总严厉教养分数集中在低至中范围（均值=5.96，SD=3.54），表明变异主要发生在常见的、非严重的行为范围内。分量表模式显示，心理攻击是最普遍的严厉教养形式（均值=3.61，SD=1.80），体罚发生频率较低（均值=2.14，SD=1.84），而身体虐待则很罕见（均值=0.20，SD=0.50）。
从发展角度看，总体严厉教养水平随时间推移而下降。总平均分从6岁时的6.77（SD±4.37）降至11岁时的6.61（SD±4.46），再到15岁时的4.34（SD±4.16）。这一趋势主要由体罚的减少所驱动，体罚从儿童早期[3.08（SD±2.67）]到青春期[0.92（SD±1.87）]持续下降。相比之下，心理攻击呈轻微的倒U型模式，在6岁至11岁间略有上升，然后在15岁时下降。身体虐待在所有年龄段都很少见。
在头发特征方面，大多数参与者为棕色头发（61.1%），37.2%为直发，53.1%每周洗头≥7次。11.0%的参与者在头发样本采集前三个月内报告使用过皮质类固醇。HCC中位数为3.69 pg/mg（IQR：2.82–4.87）。
与分析组相比，未纳入分析的组别在性别、出生体重、母亲肤色、母亲是否与伴侣同住、母亲产次和孕期吸烟方面存在显著差异（p < 0.05）。
3.2. 轨迹识别
GBTM分析确定了三个不同的严厉教养轨迹组：第1组（“低严厉教养”）、第2组（“中度严厉教养”）和第3组（“高度严厉教养”）（图2A）。在心理攻击（图2B）和体罚（图2C）领域也识别出了相同的三个轨迹。无法对身体虐待领域识别出不同的轨迹。
3.2.1. 严厉教养轨迹（总分）
低严厉教养轨迹最为普遍（n=930；51.0%）。该组在整个儿童期和青春期表现出持续低的严厉教养分数。中度轨迹包括42.9%的参与者（n=782），其特征是严厉教养水平持续高于低组。高轨迹最不常见（n=111；6.1%），在所有时间点均表现出持续高的严厉教养水平。处于高暴露轨迹的儿童更可能经历明显更不利的母亲和社会人口学环境。
3.2.2. 心理攻击轨迹
低轨迹包括9.9%的参与者（n=180），其特征是儿童早期心理攻击极少，中期略有上升，随后在青春期下降。中度轨迹最常见（n=1,005；55.1%），反映了持续中度的心理攻击水平。高轨迹包括35.0%的样本（n=638），表现为所有时间点持续高的心理攻击水平。
3.2.3. 体罚轨迹
低轨迹包括29.1%的样本（n=531），其特征是体罚水平随时间急剧下降。中度轨迹最普遍（n=1,027；56.3%），表现为轻度至中度的体罚水平。高轨迹包括14.6%的参与者（n=265），其特征是整个发展过程中持续高的体罚水平。
3.3. 童年至青春期严厉教养与15岁HCC的关联
表2展示了严厉教养与HCC关联的粗略和调整后线性回归模型结果。严厉教养总平均分和体罚平均分均与HCC呈正相关。严厉教养总分每增加一个单位，HCC的几何平均增加1%（β=1.01，95% CI：1.00, 1.02；p=0.031）。同样，体罚分数每增加一个单位，平均HCC增加2%（β=1.02，95% CI：1.01, 1.03；p=0.003）。未观察到心理攻击或身体虐待与HCC关联的证据。
关于严厉教养轨迹与HCC的关联，暴露于持续高水平严厉教养的青少年显示出较高的HCC值的趋势，增幅最高约达4%。尽管置信区间包含1，但这些估计值表明最高风险轨迹的个体长期皮质醇输出可能存在适度升高。这一趋势在总严厉教养轨迹、心理攻击轨迹和体罚轨迹中均被观察到，尽管统计精度有限。
3.4. GxE分析
观察到基因型×严厉教养对15岁HCC的交互作用。携带更多rs11621961-T等位基因的青少年在更严厉的教养背景下表现出更高的HCC，尽管效应量较小。
在整个儿童期和青春期（6、11、15岁），严厉教养每增加一分，HCC的几何均值随每个额外的T等位基因增加1–2%（βexp范围：1.01–1.02）。在rs11621961与平均严厉教养总分（β=1.01；95% CI：1.00, 1.02；p=0.029）、心理攻击（β=1.02；95% CI：1.00, 1.04；p=0.033）和体罚（β=1.02；95% CI：1.00, 1.04；p=0.043）分量表之间检测到显著的G×E交互效应。rs11621961-T等位基因调节了严厉教养的效应，使得养育方式与HCC之间的正相关随着T等位基因数量的增加而逐渐增强。除身体虐待外，这种模式在所有养育维度上均一致。结果见表3和图3（A, B, C）。
进一步研究了6至15岁严厉教养轨迹与rs11621961在预测15岁HCC时的交互作用（表4）。严厉教养总分轨迹的总体交互项具有统计学显著性（p=0.005），表明遗传效应因发展暴露模式而异。边际效应显示，在遵循中度严厉教养轨迹的青少年中，每个额外的rs11621961 T等位基因与较高的皮质醇显著相关（β=0.097；SE=0.026；95% CI：0.046, 0.147），相当于每个等位基因HCC增加约10.1%。
在心理攻击轨迹中也观察到类似的基因-环境模式，高严厉教养组的rs11621961×轨迹交互作用显著（p=0.027），相当于每个T等位基因HCC增加约7.1%（β=0.069；SE=0.022；95% CI：0.025, 0.112）。对于体罚轨迹，交互项也显著（p=0.006），边际效应表明T等位基因预测了中度轨迹青少年的较高皮质醇，相当于每个等位基因HCC增加9.2%（β=0.088, SE=0.028；95% CI：0.033, 0.144）。完整结果见表4和图3（D, E, F）。
4. 讨论
本研究探讨了从儿童期到青春期的严厉教养与HCC的关联，并探索了涉及SERPINA6/1 rs11621961变异的GxE交互作用。较高的严厉教养暴露预测了HCC水平的升高。此外，GxE交互作用显示rs11621961变异影响了跨严厉教养总分、分量表得分和轨迹的HCC，表明遗传学可能调节个体对环境因素的压力反应。
本研究发现，从儿童期到青春期暴露于严厉教养与较高的HCC水平相关。皮质醇作为HPA轴活动的标志物，在介导机体应激反应中起关键作用。文献表明，早期逆境的慢性压力会破坏皮质醇调节。本研究结果与一些显示虐待史与较高HCC相关的研究一致。
研究发现，总严厉教养分数和体罚可预测15岁时HCC升高，而心理攻击和身体虐待则无关联。这表明某些类型的严厉教养，特别是体罚，对HPA轴有更实质性的影响。体罚与HCC升高持续相关，可能是因为其引发即时且强烈的应激反应。这些发现与不同形式的严厉教养引发不同生理反应的生物学理解一致。
研究结果表明，发展不同阶段的严厉教养影响了皮质醇水平。儿童期HPA轴具有高度可塑性，压力暴露可能对其调节产生长期影响。观察到的失调可能通过损害免疫功能、促进炎症、增加代谢心血管疾病和精神健康障碍的风险，使个体易患多种健康问题。
GxE分析揭示了rs11621961变异与除身体虐待外所有领域的严厉教养在影响HCC水平上的交互作用。较高的严厉教养分数与HCC增加相关，且在携带rs11621961-T等位基因的个体中效应更明显。SERPINA6/1基因座的遗传变异涉及编码参与糖皮质激素运输和调节的蛋白质的基因，突出了其在皮质醇组织可用性中的直接遗传作用。这些发现强调，慢性严厉教养可以放大皮质醇调节中的遗传脆弱性， potentially increasing the risk for stress-related health issues.
研究结果需谨慎解读。首先，15岁时的随访率相对较低，受COVID-19大流行影响，可能影响普适性。分析队列与排除队列在性别、出生体重、母亲肤色等方面存在差异。其次，缺乏针对巴西等混合人群的功能和基因组参考面板带来挑战。再者，CTSPC由照顾者完成，反映的是报告的养育行为而非青少年的主观体验。严厉教养测量可能存在低估偏差。儿童经历的身体虐待较少可能限制了检测显著关联的能力。
尽管存在局限性，本研究具有重要优势。纵向设计提供了对严厉教养长期效应的洞察。GxE交互作用的研究更深入地理解了遗传和环境因素如何共同塑造健康结果。2004年佩洛塔斯出生队列的基于人群设计、严谨方法学、测量标准化、现场工作人员严格培训以及质量控制协议支持了结果的可靠性。研究一个种族混合的中低收入国家人群，为在不同社会经济和祖先背景下的遗传关联提供了独特见解。
总之，该研究强调了严厉教养对青少年HCC水平的显著影响。研究将严厉教养与皮质醇遗传学和慢性皮质醇水平联系起来，表明由于rs11621961变异导致的皮质醇升高遗传易感性可以放大环境压力的效应。这一证据对于理解环境和遗传影响对压力调节的长期影响至关重要。
