《Inland Waters》：Total microcystins reduce the activity of genes involved in nitrogen fixation and denitrification in lakes of the southcentral USA
摘要
蓝藻毒素（Cyanotoxins）会影响微生物，进而可能改变营养循环。为了深入探究这一问题，研究者对美国中南部的20个湖泊进行了调查，旨在更好地理解与氮（N）和磷（P）相关的细胞过程的存在（宏基因组学）和活性（宏转录组学）、总微囊藻毒素（Total microcystins）浓度以及营养水平之间的联系。研究发现，NOX浓度与总微囊藻毒素浓度相关。微囊藻毒素与多种对营养循环至关重要的细胞通路（包括氮固定、反硝化、磷吸收和代谢）的存在和活性呈负相关。总微囊藻毒素对这些通路基因存在的影响无法与NOX和其他环境因素的影响区分开来，但其对基因活性的影响则可以区分。观察到与氮固定、异化亚硝酸盐还原酶（dissimilatory nitrite reductase）及其他氮代谢的负相关。这些湖泊中的总微囊藻毒素浓度范围在0.15至0.50 μg L-1之间，峰值在1.6至2.2 μg L-1，仍低于其他系统中大型蓝藻水华期间观察到的水平。尽管如此，仍然检测到了对营养循环必需基因的存在和活性的影响。需要进行类似的研究来更好地评估微囊藻毒素对生物地球化学循环的影响。
引言
有害藻华（HAB）事件在全球几乎所有水生栖息地都有观察到。HABs本身会对生态系统和经济造成显著的负面影响，对野生动物和人类健康构成威胁。有害水华形成的浮游植物在分类学上具有多样性，许多环境条件和生物过程可以促进水华形成。HABs的发生与局部突发性影响有关，例如与水产养殖操作相关的营养负荷。区域性现象，如气候变化驱动的表层水体变暖，也可以驱动HABs的发生。在促成HAB形成的众多因素中，入流事件及其相关的水力冲刷和营养负荷受到了广泛关注。
产毒蓝藻的水华通常与高营养浓度、显著的水体分层和低水力冲刷条件相关。这些条件使得具有浮力调节、低生长速率和低可食性的细胞能够高密度积累。蓝藻水华也与低环境氮磷比（N:P）条件相关。低N:P条件有利于固氮蓝藻（diazotrophic cyanobacteria），其中一些会产生毒素。然而，在二氮气（N2）的固定和生殖生长速率之间存在能量权衡，这是因为创建和维持异形胞（heterocysts）的高成本。也可能在异形胞形成和毒素生产之间存在能量权衡，从而在有利于异形胞形成的条件下降低每个细胞的毒性。非固氮物种，如微囊藻属（Microcystis spp.），也可以产生多种蓝藻毒素。由于蓝藻毒素需要氮，在浮游生物群落中缺乏固氮物种的情况下，氮限制（N-limitation）生长可能会阻止这些化学物质的形成。因此，相对于其他营养物，较高的氮供应预计会促进蓝藻毒素的产生。
虽然外部输入的氮和磷会影响环境营养化学计量，从而影响蓝藻水华的潜力（无论是在低N:P还是高N:P条件下），湖内浮游植物和微生物也会影响化学计量。固氮蓝藻和一些异养细菌通过N2固定向湖泊系统添加氮，这在氮浓度较低和N:P较低时更为突出和高效。相反，反硝化细菌通过产生N2从湖泊系统中去除生物可利用氮，这在氮浓度较高时更为突出。此外，微生物可以通过硝化（nitrification）和氨化（ammonification）等过程改变生物可利用氮的库。许多浮游植物类群表现出对硝酸盐或铵的偏好，这些营养物的相对可用性影响着浮游植物群落的组成。
蓝藻毒素可能会破坏浮游植物和微生物驱动的过程。例如，富含微囊藻毒素的培养基显示出可以抑制细菌产生的氨肽酶（aminopeptidase）和磷酸酶（phosphatase），这些酶负责从蛋白质上切割氨基酸和在有机化合物之间转移磷酸基，表明蓝藻毒素有潜力破坏营养循环并损害代谢功能。蓝藻毒素影响生物过程的进一步证据来自研究发现，很少有细菌类群与微囊藻（Microcystis）呈正相关，并且硝化作用的季节速率与蓝藻水华呈反比。然而，该研究提出竞争铵是作用机制，但未探讨直接毒性效应。最后，对湖滨土壤和发生在底质-水柱界面的微生物群落的实验显示了微囊藻毒素对硝化作用的直接有害影响。虽然这些证据提供了一个令人信服的案例，表明蓝藻毒素破坏了浮游植物和微生物驱动的过程，但这一研究领域仍未得到充分研究。
本研究进一步探讨了蓝藻毒素破坏微生物驱动过程的观点。利用从美国中南部20个湖泊收集的三年季节性数据，研究了与N和P循环相关的细胞过程、总微囊藻毒素浓度和营养浓度之间的关系。研究采用宏基因组学评估与N和P相关的细胞通路的普遍性，并采用宏转录组学评估通路活性。
材料与方法
野外采样
研究者对美国中南部20个暖单循环湖（warm-monomictic lakes）进行了采样。所有20个湖泊都是水库，根据2010年（包括科罗拉多市湖）和2020年（其他19个湖泊）进行的水质评估，被归类为富营养化。于2021年、2022年和2023年的春季（4月）和夏季（8月）在每个湖泊的两个站点进行采样。一个站点位于水库大坝附近（深水站），另一个站点位于水库上游，水深6米，位于主要淹没的河道上方。在每个站点从表层（水面下0.5米）和底层（沉积物上方0.5-1.5米）收集离散水样。从这些离散水样中获取了用于叶绿素a（chlorophyll a）、总微囊藻毒素、营养物、宏基因组学和宏转录组学的样品。
叶绿素a
用于叶绿素a的悬浮物收集在标称孔径为0.77 μm的GF/F滤膜上，并在-20°C下储存直至实验室分析。收集一周后，这些样品在90%丙酮中过夜萃取，然后按照EPA方法445.0在 calibrated 荧光计上处理。每个样品重复处理两张滤膜。
总微囊藻毒素
使用未过滤水样测定总微囊藻毒素（游离和细胞结合）。采集后，在-20°C下储存直至分析。在实验室中，这些样品经过五次冻融循环，随后使用包被管酶联免疫吸附测定（ELISA）测试试剂盒进行分析，该试剂盒旨在估算总微囊藻毒素浓度。样品按照制造商的说明进行处理。用于定量总微囊藻毒素的分光光度读数在Hach DR6000分光光度计上分析，检测限为0.15 μg L-1。所有样品均进行重复分析。
营养物
溶解无机营养物的测定是取首先通过GF/F滤膜，然后通过0.22 μm聚丙烯滤膜（VWR）的样品滤液。这些样品在-20°C下储存直至实验室分析。溶解无机营养物的测定包括硝酸盐和亚硝酸盐（NOX）、铵（NH4）和可溶性活性磷（SRP），分别遵循EPA方法353.2（NOX）、350.1（NH4）和365.1（SRP）。使用SEAL AQ2自动离散分析仪进行无机营养物分析。还使用Shimadzu Scientific Instruments TOC-L附带TNM-L单元测定了这些样品的总溶解氮（TDN）。NOX、NH4、SRP和TDN的检测限分别为0.03 mg-N L-1、0.01 mg-N L-1、0.005 mg-P L-1和0.05 mg-N L-1。
收集未过滤水样并在-20°C下储存直至总磷（TP）分析。在实验室中，这些样品使用过硫酸盐方法消解，提取物中的TP按照EPA方法365.1在SEAL AQ2自动离散分析仪上测量。该方法的检测限为0.005 mg-P L-1。
宏基因组学与宏转录组学
收集4升水样用于总DNA提取。收集1升水样并立即用终止溶液[66 mL乙醇和1.674 mL TrizolTMLS试剂]处理用于总RNA提取。这些样品在冰上储存直至进一步处理。在采集后数小时内，DNA样品依次通过142 mm玻璃纤维（GF）GF/D滤膜和0.22 μm孔径聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜过滤。RNA样品也在采集后数小时内处理，在2021年涉及通过0.22 μm孔径Sterivex滤器过滤，在2022年通过45 mm PVDF滤膜过滤。所有滤膜在-80°C下储存直至进一步处理。
在实验室中，DNA提取使用相当于一升体积的滤膜切割部分，采用标准的酚-氯仿提取方案，其中裂解缓冲液包含400 mM NaCl, 750 mM蔗糖, 20 mM EDTA, 和50 mM Tris-HCl, pH=9.0。RNA样品在2021年使用Fast RNA Pro Soil Indirect Kit提取，在2022年使用Quick-RNA Fecal/Soil Microbe M Zymo Research提取。DNA提取物使用Nanodrop 2000定量，RNA提取物使用Qubit定量，所有提取物分别储存在-20°C和-80°C直至测序。从每个样品中，将0.5–10 μg核酸（DNA或RNA）送至Texas A&M Genomics and Bioinformatics facility进行文库制备、核糖体去除（针对宏转录组）以及使用Illumina NovaSeq S4和150 bp双末端测序技术进行测序。
研究者使用内部生物信息学流程分析序列数据。简而言之，使用软件BBMerge合并原始序列数据集的配对末端 reads。使用软件BBDuk以默认参数处理原始测序 reads 以去除Illumina接头和phiX序列。使用软件BBMask进行3'端质量修剪，并去除低熵序列（<0.7）。使用软件MEGAHIT v.1.2.9以默认参数进行从头组装。使用程序Prodigal v.2.6.3预测所有重叠群上的开放阅读框。基因预测后，使用程序DIAMOND blastp以敏感模式对NCBI-nr数据库进行基因注释。使用程序Megan 6 Ultimate Edition进行物种分类分配。使用SEED对氮和磷相关代谢途径进行基因家族注释。
与氮相关的细胞途径包括：氮代谢（指管理吸收、同化和储存的细胞过程），标记为N1；酰胺酶、尿素和腈水合酶（导致NH4和其他化合物形成的细胞过程），标记为N2；氰酸盐水解（导致NH4和其他化合物形成的细胞过程），标记为N3；反硝化还原酶（催化NO3逐步还原为氮气的酶，对反硝化至关重要），标记为N4；异化亚硝酸盐还原酶（催化NO2还原为一氧化氮的酶，在反硝化中很重要），标记为N5；腈水解酶（催化腈水解，产生NH4和其他化合物的酶），标记为N6；以及氮固定（将N2气体转化为NH4或其他氮化合物的过程），标记为N7。
与磷相关的细胞途径包括：磷酸盐代谢（指与磷的吸收、储存和利用相关的细胞过程），标记为P1；高亲和力磷酸盐转运蛋白和PHO调节子控制（感知可用性并调节转运的细胞过程），标记为P2；膦酸酯和次膦酸酯（具有多种功能的有机磷化合物，包括结构、信号传导和营养储存），标记为P3；磷酸烯醇式丙酮酸磷酸变位酶（对膦酸酯生物合成重要的酶），标记为P4；膦酸酯（亚磷酸盐）脱氢酶（催化亚磷酸盐氧化为磷酸盐的酶），标记为P5；以及另一个不同于P1的膦酸酯代谢基因簇，标记为P6。根据研究方法，细胞途径是针对浮游生物群落进行量化的，即它们不是分类群特异性的。
统计学分析
进行了主成分分析（PCA）以检验叶绿素a、总微囊藻毒素、营养物以及宏基因组数据中识别出的N和P细胞途径之间的多变量关系。进行了单独的PCA以研究宏转录组数据中的这些关系。这些PCA利用MATLAB中的统计功能。在分析之前，使用z分数对数据进行标准化。
对于每个PCA，生成相关矩阵以评估N和P细胞途径与叶绿素a、总微囊藻毒素和营养物之间的关系。然后将具有统计学显著性或接近显著性（p值接近或低于0.05）的因子用于偏相关分析，该分析在控制其他环境因素方差的情况下，评估了N和P细胞途径与总微囊藻毒素之间的关系。相关矩阵和偏相关分析均使用MATLAB编程语言中的统计功能进行。
结果
叶绿素a浓度在位于水库大坝附近的深水站大多在3至30 μg L-1之间。然而，在十个湖泊中，叶绿素a水平出现了远超出此范围的峰值。在Buffalo Springs湖和O.C. Fisher湖观察到的最高浓度在200至210 μg L-1之间。湖泊Proctor、Eagle Mountain、Worth、Waco、Bardwell、Somerville、Tawakoni和Lake O’ the Pines也偶尔显示出高叶绿素a水平。比较春季和夏季采样以及不同年份采样的观察结果显示不一致性；一些湖泊春季叶绿素a浓度与夏季相似，一些湖泊春季水平较低，另一些则较高。此外，这些模式在不同湖泊的年份间也有所不同。考虑到本研究使用的定点采样设计（每个湖泊在三年中每季节采样一次），这种变异性是预期的。叶绿素a浓度随季节和年份的变化不是本研究重点，这需要更频繁的时间采样和更精细的空间分辨率。在位于水库上游、主要淹没河道上方的6米深站点也观察到了相同的湖泊间和随时间变化的变异性。
尽管采用了定点采样设计，但在深水站观察到了总微囊藻毒素浓度在春季和夏季采样之间的差异。总微囊藻毒素在春季采样期间被检测到的频率要高得多。浓度通常在0.15至0.5 μg L-1之间。总微囊藻毒素的最高浓度（约1.6 μg L-1）在2021年春季于Buffalo Spring湖观察到。总微囊藻毒素浓度在不同年份和地区之间变化。在2021年春季，总微囊藻毒素在整个东西向采样范围内都被检测到，而在2022年春季，检测仅限于采样范围的中部和东部地区。除了Buffalo Springs湖，2022年春季的总微囊藻毒素浓度高于2021年春季。与2021年和2022年不同，在2023年夏季观察到了总微囊藻毒素浓度，但仅在四个湖泊中：O.C. Fisher、Proctor、Somerville和Tawakoni。在6米深站点，总微囊藻毒素在湖泊间和随时间变化的趋势相似，但例外的是，Buffalo Springs湖的总微囊藻毒素浓度最大值为2.2 μg L-1，并且在2023年春季在几个湖泊中观察到了总微囊藻毒素。
在春季季节观察到了一些已知产微囊藻毒素的蓝藻属的相对丰度较高，这与微囊藻毒素的观察相吻合。这些包括水华丝孢藻（Aphanizomenon）、鱼腥藻（Anabaena）、微囊藻（Microcystis）、浮丝藻（Planktothrix）、伪鱼腥藻（Pseudanabaena）和Snowella。在夏季，鱼腥藻（Anabaena）在一些湖泊中也显示出较高的相对丰度，同时还有拟鱼腥藻（Anabaenopsis）、长孢藻（Dolichospermum）、念珠藻（Nostoc）、隐杆藻（Aphanothece）、细鞘丝藻（Leptolyngbya）、隐球藻（Aphanocapsa）和集胞藻（Synechocystis）。
在深水站，NOX和TDN浓度在春季和夏季采样之间存在明显差异，但NH4则没有。通常（尽管并非总是如此），NOX和TDN水平在春季高于夏季。最高的NOX浓度在0.6至2.2 mg-N L-1之间，发现于Buffalo Springs、Benbrook、Bardwell和Ray Hubbard湖。这些湖泊显示从春季到夏季NOX水平下降，夏季水平约为0.05 mg-N L-1。Henry、Colorado City、E.V. Spence、O.C. Fisher、Brownwood、Hubbard Creek、Possum Kingdom、Eagle Mountain、Somerville和Lake O’ the Pines湖在六个采样期内的NOX最大值接近或低于0.05 mg-N L-1。最高的TDN水平在1.5至2.5 mg-N L-1之间，在Buffalo Springs、Colorado City、O.C. Fisher和Somerville湖观察到。大多数湖泊在六次采样中的TDN最大值接近或低于1.0 mg-N L-1。对于大多数采样事件，NH4低于检测限，除了在2022年夏季采样期间，一些湖泊显示出浓度在0.2至0.8 mg-N L-1范围内。在6米深站点观察到了NOX、NH4和TDN在湖泊间和随时间变化的相似趋势。
磷、SRP和TP在深水站显示出不同的趋势。对于SRP，在2021年和2022年，春季观察到较高浓度，范围在0.04至0.07 mg-P L-1。夏季，采样范围西部湖泊的浓度降至检测限以下。相比之下，中部和东部地区的湖泊夏季浓度在0.005至0.06 mg-P L-1范围内。2023年，SRP低于检测限。这种年际趋势反映在TP上，TP浓度随时间下降，但O.C. Fisher和Proctor湖除外，前者TP增加，后者保持相似。在TP下降的湖泊中，采样早期TP范围在0.075至0.1 mg-P L-1，到末期降至0.005至0.05 mg-P L-1范围内。在6米深站点观察到了SRP和TP在湖泊间和随时间变化的相似趋势。
Redfield Ratio被用作粗略估计，以确定一个系统的浮游植物是否可能受到氮限制（当比率低于7.2，质量:质量）或磷限制（当比率高于7.2）。在所采样的湖泊中，深水站的TDN/SRP大多大于7.2，在某些情况下甚至高得多。偶尔，TDN/SRP达到或低于Redfield Ratio，包括2021年夏季的Proctor湖，以及2022年春季采样的Twin Buttes、Somerville和Ray Hubbard湖。在6米深站点观察到了TDN/SRP在湖泊间和随时间变化的相似模式。
在深水站的宏基因组数据中，细胞途径在湖泊间存在相当大的变异。尽管存在这种变异，一些季节性模式是明显的。例如，对反硝化重要的反硝化还原酶（N4）和异化亚硝酸盐还原酶（N5）途径在夏季显示出最高水平，在2021年的Possum Kingdom湖和2023年的Worth湖有显著峰值。固氮途径（N7）在所有三个采样年份的夏季通常也具有较高水平，几个湖泊在不同年份显示出峰值。在6米深站点也观察到了宏基因组细胞途径数据在湖泊间和随时间变化的高度变异性。
对来自深水站和6米站点合并的湖泊学参数、总微囊藻毒素浓度以及细胞途径的宏基因组数据进行的主成分分析揭示了几个关联。检查主成分1和2（占总方差的31.9%），最强的正相关存在于总微囊藻毒素、NOX和TDN之间。在主成分1和2上，涉及总微囊藻毒素的最强负相关是与固氮（N7）、异化亚硝酸盐还原酶（N5）、氮代谢（N1）、磷和磷酸盐代谢（P1）、膦酸酯和次膦酸酯（P3）以及膦酸酯脱氢酶（P5）途径。
对湖泊学参数、总微囊藻毒素浓度以及细胞途径宏基因组数据之间相关系数的分析（使用来自深水站和6米站点的合并数据）揭示了与涉及反硝化还原酶（N4）、腈水解酶（N6）、固氮（N7）、磷和磷酸盐代谢（P1）以及高亲和力磷酸盐转运蛋白和PHO调节子控制（P2）途径的统计学显著（或边缘显著）关系。这些选定细胞途径与总微囊藻毒素之间的偏相关分析，在控制也显示出统计学显著相关的湖泊学参数后，并未产生统计学显著的关系。注意，磷和磷酸盐代谢（P1）途径与总微囊藻毒素之间的偏相关分析未进行，因为没有其他因子与P1途径显著相关。
与宏基因组细胞途径数据一样，深水站的宏转录组细胞途径数据在湖泊间也存在强烈变异。尽管存在这种变异，一些季节性趋势是明显的，但在年份间不一致。例如，与夏季相比，反硝化还原酶（N4）在2021年春季较高，尤其是在Colorado City、Ray Hubbard和Tawakoni湖。然而，与夏季相比，反硝化还原酶（N4）在2023年春季较低，如在Colorado City、Brownwood、Ray Hubbard和Lake O’ the Pines湖所见。异化亚硝酸盐还原酶（N5）在夏季更常见，固氮（N7）也是如此，几个湖泊显示出的最高水平随年份变化。在6米深站点也观察到了宏转录组细胞途径数据在湖泊间和随时间变化的高度变异性。
对来自深水站和6米站点合并的湖泊学参数、总微囊藻毒素浓度以及宏转录组细胞途径数据的主成分分析也揭示了几个关联。检查主成分1和2（占总方差的33.5%），最强的正相关存在于总微囊藻毒素和NOX之间。涉及总微囊藻毒素的最强负相关是与固氮（N7）、异化亚硝酸盐还原酶（N5）、氰酸盐水解（N3）、氮代谢（N1）、磷和磷酸盐代谢（P1）以及高亲和力磷酸盐转运蛋白和PHO调节子控制（P2）途径。
对湖泊学参数、
