《Bioactive Materials》：3D-printed triboelectric scaffolds for fabricating BMSC-derived cartilage to repair bone defects and promote endochondral ossification
编辑推荐：
本研究针对难治性骨缺损修复中存在的缺血缺氧微环境挑战，创新性地将组织工程与电疗法相结合。研究人员开发了由可降解生物弹性体PGS和导电材料PEDOT:PSS构成的3D打印摩擦电支架（TES），用于构建骨髓干细胞（BMSC）源性组织工程软骨。结果表明，TES支架具有良好的生物相容性、导电性和摩擦电性能，能够在体内通过生理活动产生自供电电刺激。体外实验证实TES可显著促进BMSC的软骨向分化；体内实验表明TES能有效加速软骨内骨化（ECO）过程，促进骨缺损修复。蛋白质组学分析揭示其机制与促进肌动蛋白细胞骨架重塑、激活PI3K-Akt通路、增强细胞间通讯密切相关。该研究为修复难治性骨缺损提供了有效的生物策略。
骨缺损是骨科常见疾病，不仅导致疼痛和功能障碍，还可能引发骨髓炎、骨坏死等严重并发症，严重影响患者生活质量。传统的骨移植治疗方法，如自体骨和异体骨移植，面临着供体来源有限、免疫排斥等挑战。骨再生主要通过两种成骨途径实现：膜内成骨（IMO）和软骨内骨化（ECO）。膜内成骨是间充质干细胞（MSC）直接分化为成骨细胞的过程，但在缺乏血管化的条件下，其效果往往受限，容易导致中心缺血性坏死和成骨失败。相比之下，天然骨修复主要依赖于软骨内骨化，这是一个包含免疫调节、血运重建、软骨形成和骨生成四个连续阶段的精密调控过程。因此，利用干细胞诱导构建组织工程软骨，通过模拟软骨内骨化过程来修复骨缺损，已成为当前研究的前沿。然而，如何进一步提高其骨再生效率仍是亟待解决的关键问题。
电刺激（ES）作为一种非药物干预手段，通过材料界面的导电特性与直接电刺激的协同作用调控骨再生。导电材料不仅能增强骨髓间充质干细胞（BMSC）的粘附和定植能力，还能通过激活钙离子通道和调控miRNA表达促进BMSC增殖和成骨分化。然而，现有的压电材料在3D打印过程中晶体结构易受损，导致电输出不稳定且机械相容性差；导电水凝胶则常存在机械稳定性不足、需依赖外部刺激间接发电以及部分材料的生物安全性等问题。摩擦纳米发电机（TENG）能够有效地将机械能转化为电能，但传统的TENG在潮湿环境下电输出性能会下降，往往需要封装才能保证体内稳定运行。
针对上述挑战，发表在《Bioactive Materials》上的一项研究提出了一种创新策略：利用3D打印的摩擦电支架（TES）构建BMSC源性组织工程软骨用于骨再生。该研究旨在设计一种具有优异摩擦电性能的3D打印TES，基于此支架构建BMSC源性组织工程软骨，阐明TES通过自供电电刺激调控软骨内骨化的分子机制，并验证其在修复临界尺寸骨缺损方面的可行性。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：首先，采用3D打印技术制备了以聚癸二酸甘油酯（PGS）为基质、聚（3,4-乙烯二氧噻吩）：聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）为导电组分的TES支架，并通过盐沥滤技术构建了多级分层多孔结构。其次，利用新西兰大白兔分离获取BMSC，并在TES支架上进行体外培养和软骨向诱导，成功构建了组织工程软骨。关键的体内实验包括将构建好的组织工程软骨植入裸鼠皮下和兔颅骨缺损模型，以评估其体内成骨能力。此外，研究还综合运用了扫描电子显微镜（SEM）观察支架形貌，力学测试评估支架性能，电学测试表征摩擦电输出，Micro-CT（微计算机断层扫描）分析骨再生情况，组织学染色（如H&E、Masson、SO-FG、COL2、OCN等）和免疫荧光染色（如COL1、COL2、CD31、α-SMA）评估组织形成和血管化，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测基因表达，以及蛋白质组学分析来深入探究其分子机制。
2.1. TES的设计与表征
研究人员通过3D打印技术制备了TES，其基质为PGS，导电组分为PEDOT:PSS。支架具有多级分层结构：一级结构由3D打印模型决定，二级结构是打印丝线的排列，三级结构则是盐颗粒去除后形成的相互连接的微孔网络，这些微孔是TES的基本工作单元。力学测试表明，随着PEDOT:PSS含量的增加，TES的压缩强度和模量也随之增加，并且在20次机械压缩循环后未观察到明显滞后，显示出优异的弹性。体外酶降解实验显示，TES在8小时后质量损失约74%，表明其具有良好的可降解性。体内生物相容性和降解性评估在裸鼠皮下进行，结果显示TES支架随时间推移逐渐降解，且组织整合、血管生成和炎症反应过程良好。
2.2. TES的摩擦电性能
电学测试评估了不同PEDOT:PSS含量TES的电输出性能。在干燥条件下，含有5 wt% PEDOT:PSS的TES表现出最佳的电输出性能，电压约为5 V，电流为60 nA，并且在1000次压缩循环后仍能保持稳定的输出电压。在模拟体内潮湿环境（如PBS、生理盐水和组织液）中，5 wt% PPGS制备的TES仍能产生有效的电输出。更重要的是，在植入裸鼠皮下后，TES在多种压缩模式下（如连续压缩、分离压缩）均能产生规律的电信号，而纯PGS对照组信号可忽略不计，证实了TES在体内产生电刺激的能力。即使在酶降解过程中，随着质量减少，TES的电输出逐渐减弱，但在质量损失约67%时仍能产生0.5 V的峰值电压。
2.3. BMSC源性组织工程软骨的体外构建
将兔源BMSC接种于PGS支架和TES支架（5 wt% PEDOT:PSS制备）上，进行为期四周的体外软骨向诱导分化，成功构建了组织工程软骨。组织学切片染色（H&E、MASSON、SO-FG、COL2）显示，两种支架的新生组织均分布于3D打印支架的纤维间隙中，但TES组的新生组织细胞和细胞外基质分布更致密均匀，且与支架融合更好。COL2染色表明TES组表达了大量软骨特异性II型胶原，其表达水平显著高于PGS组。定量分析显示，TES组的组织再生率和软骨再生率均显著高于PGS组，DNA、糖胺聚糖（GAG）和总胶原含量也略高。RT-qPCR结果证实，TES组软骨相关基因SOX9和COL2的表达显著上调，表明TES支架在基因调控水平能更有效地促进BMSC向软骨细胞分化。
2.4. 裸鼠体内软骨内骨再生
将体外构建的PGS组和TES组组织工程软骨植入裸鼠皮下，培养8周后评估其成骨潜力。大体观察和Micro-CT检测显示，TES组再生骨组织的矿化面积显著大于PGS组。定量参数分析表明，TES组的骨体积（BV）、骨矿物密度（BMD）和平均骨小梁厚度（Tb.Th）均显著优于PGS组。组织学检查发现，TES组整体结构坚固，骨样组织呈骨特异性染色阳性；而PGS组因支架降解过快，部分区域出现中空结构，残留组织仍处于软骨状态。免疫荧光染色显示，TES组的I型胶原（COL1）荧光信号均匀分布在整个组织块中，而II型胶原（COL2）信号几乎消失，表明TES组可能加速了软骨细胞向成骨细胞的分化转变。同时，CD31和αSMA双标染色显示TES组组织块内外均有血管分布，而PGS组血管仅局限于外围。定量分析和qPCR结果进一步支持了TES能够加速细胞从软骨谱系向成骨谱系分化，从而驱动软骨内骨化过程。
2.5. TES促进软骨内骨化的分子机制
通过对裸鼠皮下培养8周后的再生骨样本进行蛋白质组学测序，分析了PGS组和TES组之间的蛋白表达差异。主成分分析（PCA）显示两组蛋白表达存在显著差异。差异表达蛋白（DEP）分析发现，TES组有582个上调蛋白和975个下调蛋白。基因本体（GO）富集分析表明，TES组显著富集了与肌动蛋白丝动力学调控、ephrin受体信号通路和突触组装正调控等相关的术语。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，TES激活了PI3K-Akt信号通路、细胞外基质（ECM）-受体相互作用以及氨基糖和核苷酸糖代谢等关键通路。热图分析进一步证实TES上调了Thbs4、Slit3、Mmp2、Mmp9、Camk2d和Akt1等基因。这些结果表明，TES通过协调肌动蛋白细胞骨架重塑、增强细胞间和细胞-基质相互作用、激活成骨分化相关信号通路以及调控ECM更新，促进了软骨细胞经历成熟、肥大化最终成骨的过程。
2.6. 兔颅骨缺损的原位修复
研究人员进一步在兔颅骨缺损模型中验证TES的修复效果。实验设置了组织工程软骨PGS组、组织工程软骨TES组和未处理的空白对照组。术后12周，Micro-CT扫描和定量分析指标（BV、BV/TV、BMD、Tb.Th）均表明TES组再生颅骨组织的矿化面积最大，修复效果显著优于PGS组和空白对照组。组织学检查显示，空白对照组缺损区仅见部分不完全的骨再生，主要为疏松纤维结缔组织；PGS组缺损区矿化骨组织增多，骨小梁数量和密度显著高于空白组，但仍存在部分未完全矿化的类骨质；而TES组缺损区则完全被大量连续的新生骨组织填充。OCN特异性免疫组化染色显示TES组缺损区OCN阳性信号显著强于其他两组，且阳性细胞连续分布。CD31+αSMA免疫荧光双染证实TES组新生骨组织内血管数量显著多于其他两组，且血管穿透更深、分布更均匀。这表明TES通过促进功能性血管形成，改善了骨再生微环境。
该研究成功利用3D打印TES诱导构建了BMSC源性组织工程软骨。在体外诱导阶段，TES相较于PGS能显著促进BMSC的软骨向分化。在体内应用中，TES的自供电电刺激加速了软骨内骨化过程，有效促进了骨缺损的再生修复。蛋白质组学分析揭示，TES的成骨机制与肌动蛋白细胞骨架重塑、信号通路激活、代谢支持以及增强细胞间通讯密切相关。尤为重要的是，基于3D打印TES的BMSC源性组织工程软骨成功应用于兔颅骨缺损修复，取得了显著的再生效果。这项研究不仅为骨缺损修复提供了一种创新的、有效的生物策略，而且深入阐明了电刺激促进骨再生的分子机制，为后续研究和临床转化奠定了坚实的基础。研究的优势在于其支架材料生物相容性好、可降解，电刺激方式为自供电、非侵入性，且通过多维度实验验证了其有效性。未来研究可进一步优化支架结构以适应承重骨的需求，并推进其标准化生产和个性化定制，以期最终应用于临床修复难治性骨缺损。
