超顺磁性Fe?O?纳米簇通过协同化疗和神经外泌体（NETs）降解作用，用于癌症治疗及转移预防

《Biomaterials Advances》：Superparamagnetic Fe 3O 4 nanoclusters for cancer therapy and metastasis prevention via synergistic chemotherapy and NETs degradation

超顺磁Fe3O4纳米团簇共载DOX和DNase，通过交替磁场实现磁热疗与化疗协同，同时降解NETs改善肿瘤微环境，显著抑制原发肿瘤及转移。

　　

谢立勤|曾天毅|李丹|常文珂|纪胜路|华志春

新乡医学院生命科学技术学院，中国新乡市金水路601号，453003

摘要

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的过度表达是肿瘤发生和转移的关键生物标志物和介质。通过抑制其形成或降解现有结构，针对NETs的治疗策略在癌症治疗和转移预防方面显示出巨大的潜力。脱氧核糖核酸酶I（DNase）虽然能有效降解NETs，但由于其在血浆中的清除速度较快，需要使用递送载体来延长其治疗效果。在本研究中，我们通过一步溶热法制备了超顺磁性Fe₃O₄纳米簇，用于多柔比星（DOX）和DNase的共同递送。该纳米平台表现出：（1）在肿瘤部位具有增强的磁保留能力，从而提高局部药物浓度和实现靶向递送；（2）在交替磁场（AMF）作用下具有协同治疗效果，结合了磁热疗和化疗，并通过降解NETs重塑肿瘤微环境。综合评估表明，这种联合方法比单一疗法显著增强了抗肿瘤效果，同时通过调节肿瘤微环境还具有预防转移的额外优势。因此，这种多功能纳米平台代表了协同癌症治疗的一种有前景的策略，能够同时控制原发肿瘤和抑制转移。

引言

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是中性粒细胞的一种新型防御机制，最初由Brinkmann发现[1]、[2]。这些网状结构主要由染色质、脱氧核糖核酸（DNA）和多种抗菌蛋白组成。尽管NETs在捕获和消除病原体方面起着关键作用，但它们的过度释放与某些病理状况有关[3]。临床研究表明，异常的NETs形成与多种疾病相关，包括血栓形成、先兆子痫、慢性炎症性疾病和心肌缺血-再灌注损伤。肿瘤微环境的特点是炎症活动增强[4]，这也导致了NETs产量的增加。Demers在2012年首次提出了肿瘤介导的NETs释放现象[5]。Berger-Achituv（2013年）的研究提供了NETs存在于儿童Ewing肉瘤组织中的直接证据，并进一步描述了肿瘤相关中性粒细胞NETosis的现象[6]。重要的是，持续的NETs释放会促进慢性炎症，从而形成有利于肿瘤进展和转移的微环境[7]。

研究表明，与健康个体相比，癌症患者（如肺癌、胰腺癌和膀胱癌患者）的血浆中NETs水平显著升高[8]、[9]。Yang发现NETs通过促进人脐静脉内皮细胞的增殖[10]、迁移和管腔形成来促进胃癌的血管生成。此外，抑制NETs可以通过减少微血管密度来抑制肿瘤生长，证实了其促肿瘤作用。在非酒精性脂肪性肝炎相关肝病中，Wang观察到NETs的积累[11]，这通过代谢重编程诱导了调节性T细胞（Tregs）的分化。由于Tregs可以抑制抗肿瘤免疫，这一机制可能有助于肿瘤的免疫逃逸和进展。此外，Yan Li在肺癌中发现了一个反馈循环[12]：肿瘤细胞释放的胞外RNA（exRNAs）激活上皮细胞形成NETs，进而触发上皮细胞坏死，释放更多的exRNAs。这种NETs-exRNAs的级联反应加剧了炎症并促进了肿瘤发生。NETs在结直肠癌（CRC）中的作用已有大量文献记载。Richardson报告称，在所有肿瘤阶段的CRC患者中NETs水平均升高[13]，包括晚期病例。同样，Xuehua Kong在CRC患者的组织和血液样本中发现了NETs的增加[14]，这些NETs间接加速了肿瘤进展。值得注意的是，循环中的NETs与癌胚抗原结合后，成为预测CRC发生和转移的潜在生物标志物。

除了促进肿瘤起始外，NETs还积极塑造了一个有利于转移的微环境。Yang发现NETs在乳腺癌和结肠癌的肝转移灶中大量积累[15]。他们的研究表明，NETs中的DNA成分（NETs-DNA）作为配体与癌细胞表面的CCDC25蛋白结合，激活ILK-β-parvin通路，招募循环肿瘤细胞并建立远处转移。值得注意的是，在CCDC25敲除模型中，这种转移机制被消除，证实了NETs-CCDC25相互作用在转移中的关键作用。NETs还通过诱导促肿瘤炎症来增强转移潜力。在肝细胞癌中，NETs物理上捕获肿瘤细胞。内化后，这一过程触发TLR4/9-COX2信号通路，从而激活转移行为[16]。Xiaohe Zhou发现了另一种机制，即肿瘤来源的自噬体通过高迁移率盒1（HMGB1）依赖性激活TLR4-Myd88-ERK/p38通路来刺激NETs的形成[17]。这些NETs随后损害T细胞功能，在肺部形成免疫抑制性的转移前微环境。其他研究表明，手术应激会提高术后NETs水平。在这种炎症环境中，NETs通过多种方式促进转移。它们可以物理捕获循环肿瘤细胞[18]，激活β1-整合素、HMGB1和基质金属蛋白酶-9等转移相关因子[19]、[20]、[21]，并触发支持转移的信号通路[8]、[20]、[21]、[22]。

鉴于NETs在促进肿瘤转移中的关键作用，抑制NETs的形成或破坏现有的NETs代表了一种有前景的治疗策略。Huan Zhao证明二氢丹参酮I不仅抑制NETs的形成，还能减轻NETs诱导的转移扩散[23]。类似地，白藜芦醇通过激活SIRT1来抑制NETs的生成，从而减少乳腺癌的肺转移[24]。Yanze Yin报告说，富含组氨酸的糖蛋白与中性粒细胞上的FcγR1结合[25]，通过抑制IL-8-MAPK/NF-κB通路和活性氧的产生来抑制NETs的形成，最终在肝癌模型中预防肺转移。除了抑制NETs外，针对NETs来重塑肿瘤微环境和增强抗肿瘤免疫也成为一种有效策略。例如，DNase治疗与抗PD-L1疗法结合使用，可以在肿瘤微环境中恢复T细胞功能，从而抑制肿瘤生长[26]。利用光热/光动力纳米颗粒的创新方法已被开发出来，以诱导免疫细胞死亡、促进树突状细胞成熟、激活T细胞，从而防止术后肿瘤复发[27]。

直接破坏NETs也显示出显著的治疗潜力。Huiyi Liang使用基于聚天冬氨酸的阳离子材料阻断NETs-DNA与CCDC25之间的相互作用[28]，有效抑制NETs介导的癌细胞趋化性和迁移。虽然DNase可以降解NETs的DNA骨架[29]、[30]、[31]，但其临床应用需要递送系统来延长其短暂的血浆半衰期。为了解决这个问题，Jiayuan Chen开发了具有等离子体金核和介孔聚多巴胺壳的AuPB@mPDA纳米颗粒，以实现可控的DNase释放[32]，有效防止NETs介导的循环肿瘤细胞捕获和转移播种。Zhaozhong Wang设计了融合了CCDC25并封装了DNase的脂质体，能够有效清除NETs并抑制肝脏转移前微环境的形成[33]。此外，还设计了将DNase与化疗药物结合的递送系统，实现肿瘤微环境响应性释放，同时进行肿瘤治疗和转移预防[34]、[35]。总的来说，这些研究表明，无论是通过抑制、降解还是免疫调节来靶向NETs，并结合化疗、免疫疗法或其他治疗方式，都是一种强有力的策略，可以抑制肿瘤进展和转移扩散。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Fe₃O₄）由于其独特的超顺磁性质、优异的生物相容性和易于表面功能化，已成为药物递送系统中的多功能纳米载体[36]、[37]、[38]、[39]。这些特性使其适用于磁靶向、热疗和可控药物递送。在本研究中，我们通过一步溶热合成方法制备了Fe₃O₄纳米簇[40]，使用FeCl₃•6H₂O作为铁前体，乙二醇（EG）作为溶剂。该纳米平台同时装载了两种治疗剂：用于肿瘤抑制的化疗药物多柔比星（DOX）和用于降解NETs的DNase。如图1所示，这种多功能系统通过顺序机制发挥作用。首先，Fe₃O₄/DOX/DNase复合物通过磁保留作用在肿瘤部位聚集，从而显著提高局部药物浓度。随后，磁场诱导的加热触发快速释放有效载荷，DOX与热疗协同作用杀死肿瘤细胞，而DNase降解NETs-DNA以破坏促转移微环境。这种联合作用同时抑制原发肿瘤生长并防止远处转移。

材料

丙烯酸钠（NaAA）、溴乙酸（BA）、抗坏血酸钠（SA）、氯化铜（CuCl₂）、N,N,N,N,N,N-五甲基二乙烯三胺（PMEDTA）、DNase和盐酸多柔比星（DOX·HCl）从Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.（上海，中国）购买。六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂）、乙二醇（EG）、醋酸钠、4%甲醛和比色蛋白测定试剂盒（BCA）从北京鼎国长盛生物技术有限公司获得。

Fe₃O₄纳米簇的结构、形态和性能

Fe₃O₄纳米簇通过溶热法成功合成，使用PAAS作为缩合核和稳定剂。PAAS的负电荷羰基不仅促进了定义明确的纳米簇的形成，还赋予了它们优异的水分散性，表现为ζ电位为-18 mV，平均水动力直径为183.1 nm，多分散指数（PDI）为0.24（图1A）。通过FT-IR光谱进行了表征

结论

本研究通过一步溶热法合成了单分散的Fe₃O₄纳米簇，具有均匀的形态、高磁响应性和良好的细胞相容性。Fe₃O₄纳米簇对DOX和DNase具有高载药能力，共同递送系统Fe₃O₄/DOX/DNase在体外表现出双重治疗效果：显著抑制4T1乳腺癌细胞的增殖和高效的NETs降解。

CRediT作者贡献声明

谢立勤：撰写——原始草案、软件开发、研究设计、资金获取、数据管理、概念构思。曾天毅：撰写——原始草案、数据管理。李丹：数据验证。常文珂：数据管理。纪胜路：软件开发、数据管理。华志春：撰写——审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了河南省科技研究项目（编号：252102311233）和新乡医学院基础研究基金（编号：505089）的支持。我们还要感谢新乡医学院第三附属医院提供的小动物活体成像设施。