三元掺杂铁氧体纳米颗粒(MxFe3-xO4)在3D人肝细胞模型中的生物安全性：细胞毒性、基因毒性及氧化应激响应的综合评估

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Safety of ferrite nanoparticles for biomedical applications: Cyto- and genotoxic effects of M xFe 3-xO 4 (M = Fe, Zn, Mn) in an Advanced 3D human hepatic in vitro model

本研究针对生物医学应用中铁氧体纳米颗粒（MNPs）安全性数据缺乏的问题，通过先进3D人肝细胞（HepG2）球体模型，系统评估了γFe2O3（FeNPs）、Zn0.7Fe2.3O4（ZnNPs）和Mn0.4Fe2.6O4（MnNPs）的细胞毒性、基因毒性及氧化应激效应。结果表明，MNPs的毒性具有时间与成分依赖性，虽诱导低水平DNA损伤，但未引发双链断裂或脂质过氧化，为其生物医学应用安全性提供了关键实验依据。

　　

随着纳米技术在生物医学领域的飞速发展，磁性纳米颗粒（Magnetic Nanoparticles, MNPs）因其独特的物理化学性质，在靶向药物递送、磁热疗、医学成像等应用中展现出巨大潜力。其中，尖晶石型铁氧体纳米颗粒（Spinel-Type Ferrite Nanoparticles）可通过掺杂不同金属离子（如锌、锰）精确调控其磁性和催化性能，成为研究热点。然而，这些纳米材料在人体内的生物安全性，尤其是对主要代谢器官——肝脏的潜在毒性，仍缺乏系统评估。传统二维（Two-Dimensional, 2D）细胞模型难以模拟体内复杂的组织微环境，其预测价值有限，这成为纳米材料临床转化的重要障碍。

为解决上述问题，由Iza Rozman、Alvaro Gallo-Cordova等来自斯洛文尼亚国家生物学研究所（National Institute of Biology）和西班牙材料科学研究所的研究团队，在《Biomedicine》上发表论文，首次利用先进的3D人肝癌细胞（HepG2）球体模型，全面评估了三种柠檬酸包覆的铁氧体纳米颗粒（M_xFe_3-xO₄, M = Fe, Zn, Mn）的细胞毒性、基因毒性及氧化应激效应。

研究采用了几项关键技术方法：通过微波辅助多元醇法可持续合成纳米颗粒并进行表征（包括ICP-OES、TEM、XRD、FTIR、DLS）；利用HepG2细胞通过力悬浮法构建3D球体模型进行毒性评估；通过CellTiter-Glo?法检测细胞活力（ATP含量），DCFH-DA探针和MDA测定法评估活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）生成和脂质过氧化；采用碱性彗星实验、γH2AX和p-H3流式细胞术分析基因毒性；并运用毒性基因组学方法（qPCR）分析相关基因表达。

3.1. 纳米颗粒表征

研究人员首先对合成的三种纳米颗粒（FeNPs, ZnNPs, MnNPs）进行了详细表征。透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）显示它们均为准球形至略具棱角的形态，FeNPs和ZnNPs的平均粒径约为14纳米，而MnNPs显著更小，约为7纳米，这意味着其具有更大的比表面积。X射线衍射（X-ray Diffraction, XRD）证实了它们的尖晶石晶体结构，且晶粒尺寸与TEM结果一致，表明颗粒主要为单晶。动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）分析显示，所有颗粒在水溶液中均具有良好的胶体稳定性，MnNPs的水合粒径最小（约36纳米）。傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）成功验证了柠檬酸包覆的存在。这些结构差异是影响其后续生物学行为的关键因素。

3.2. 纳米颗粒在球体中的渗透和细胞内化

利用TEM观察纳米颗粒在3D球体中的分布是本研究的一大亮点。结果发现，无论哪种成分的MNPs，在暴露24小时和96小时后，其积累均主要局限于球体的外围细胞层。内部化的纳米颗粒被发现在最外层细胞的胞质内，通常包裹在囊泡结构中。而球体的内部细胞层则几乎没有检测到纳米颗粒。这表明3D球体致密的架构和高细胞密度对纳米颗粒向内部的扩散构成了显著屏障。

3.3. MNPs的细胞毒性

通过检测ATP含量来评估细胞活力发现，三种MNPs均表现出浓度和时间依赖性的细胞毒性。暴露24小时后，MnNPs的毒性最强（IC₅₀= 43.23 μg/mL），其次是ZnNPs（IC₅₀= 48.43 μg/mL），FeNPs毒性相对最低（IC₅₀= 96.37 μg/mL）。暴露96小时后，毒性效应更加明显，顺序不变（MnNPs > ZnNPs > FeNPs）。考虑到TEM显示纳米颗粒内化有限，作者推测细胞毒性可能源于纳米颗粒与细胞膜的相互作用、金属离子释放或ROS生成，而非主要依赖于细胞内吞。

3.4. 氧化应激和氧化损伤

活性氧（ROS）检测显示，暴露4小时后，FeNPs和MnNPs能诱导剂量依赖性的ROS生成，而ZnNPs则无此效应。这归因于铁离子的芬顿反应（Fenton reaction）活性和锰离子对芬顿反应的促进作用，而锌离子则具有抗氧化特性。然而，作为脂质过氧化标志物的丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平在所有样品和暴露时间点均未发生显著变化。毒性基因组学分析显示，除暴露于最高浓度FeNPs 24小时后，抗氧化基因谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）有轻微上调外，其他氧化应激反应基因（如SOD1, CAT, GCLC, GSR）的表达均无显著改变。这表明细胞的抗氧化防御系统可能被有效激活，清除了ROS，从而避免了脂质损伤。

3.5. FeNPs、ZnNPs和MnNPs的潜在体外基因毒性

基因毒性评估是安全性的核心。碱性彗星实验结果显示，在暴露24小时后，ZnNPs和MnNPs在最高浓度下引起了轻微的但具有统计学意义的DNA损伤；而暴露96小时后，所有三种MNPs均诱导了显著的DNA损伤增加。然而，对DNA双链断裂（Double-Strand Breaks, DSBs）标志物γH2AX和用于指示染色体错误分离（aneugenic effects）的标志物p-H3进行流式细胞术分析发现，在所有测试浓度和时间点，均未发现这两种标志物的阳性事件增加。这表明观察到的彗星实验中的DNA损伤可能不是由直接导致双链断裂的克隆性物质或干扰有丝分裂的诱变剂引起的，更可能是由氧化性DNA损伤（如碱基氧化）或其修复过程中产生的短暂性单链断裂所致。毒性基因组学分析进一步支持了这一结论：DNA损伤应答基因（如GADD45A, CDKN1A）和抗凋亡基因BCL2在96小时暴露后出现轻微上调，提示细胞启动了DNA修复和生存适应机制，但未引发强烈的基因毒性应激反应。

综上所述，本研究首次在生理相关性更高的3D人肝细胞球体模型中，系统评估了三种不同金属掺杂的铁氧体纳米颗粒的生物安全性。研究结果表明，这些纳米颗粒的毒性效应（包括细胞毒性和基因毒性）具有明显的时间和成分依赖性。虽然它们能诱导一定程度的ROS生成和DNA损伤（彗星实验），但并未引发严重的双链断裂、脂质过氧化或强烈的基因表达紊乱。特别是，ZnNPs和MnNPs表现出比纯铁氧化物（FeNPs）更高的细胞毒性，但其基因毒性风险仍属较低水平。这些发现强调了在评估纳米材料安全性时，考虑暴露时间、材料组成以及使用先进3D模型的重要性。该研究为铁氧体纳米颗粒在靶向药物递送、磁热疗等生物医学领域的潜在安全应用提供了重要的实验数据和安全评估框架，并指出未来需要进一步开展长期暴露和机制探索研究。